بررسی تاثیر تیمار با داروی گلیبوراید بر روی بیان فاکتور های التهابی و ضد التهابی در سلول های دندریتیک مشتق از مونوسیت
The study of Glyburide effect on the expression of inflammatory and anti-inflammatory factors in monocyte-derived dendritic cells
مجریان: بهزاد برادران , توحید کاظمی
خلاصه روش اجرا: پس از جداسازی سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) با استفاده از محلول فایکول، با تکنیک MACS به صورت Positive selection توسط آنتی بادی های ضد CD14، مونوسیتها را از سایر سلولها جدا خواهیم نمود، به طوری که ابتدا سایر سلولها( به غیر از مونوسیت ها) به صورت Unlabeled از ستون MACS خارج خواهند شد اما مونوسیت ها به خاطر داشتن مارکر CD14 و اتصال به آنتی بادی ضد آن به بید ها در ستون قرار داده شده در داخل میدان مغناطیسی متصل خواهند ماند. که سپس با استفاده از بافر و پیستون آن سلولهای مونوسیتی را از ستون خارج خواهیم کرد و در لوله ای جمع آوری خواهیم نمود. مونوسیت های به دست آمده در پلیتهای 6 چاهک با استفاده از RPMI-1640 دارای 10% FBS، پنیسیلین 100U/ml، استرپتومایسین 100 ug/ml، پنجاه میکرومولار 2-مرکاپتواتانول، GM-CSF(40ug/ml)و IL-4(20ug/ml) کشت خواهند شد. پلیت ها در انکوباتور 37°C با 5 % CO2 قرار داده خواهند شد و روزانه به طور مداوم از نظر آلودگی بررسی می شوند. در روز سوم تعویض محیط با استفاده از RPMI-1640 دارای 10% FBS، پنیسیلین 100U/ml، استرپتومایسین 100 ug/ml، پنجاه میکرومولار 2-مرکاپتواتانول، GM-CSFو IL-4 انجام خواهد شد. در روز ششم LPS ( 100ng/ml) برای فعال کردن DC ها به محیط کشت اضافه گردیده و 24 ساعت انکوبه خواهند شد ، علاوه بر LPS (به عنوان سیگنال اول) به Extracellular Adenosine-5’-triphosphate (ATP) (به عنوان سیگنال دوم) برای ایجاد Potassium efflux و نهایتا فعال کردن NLRP3 اینفلامازوم در DC ها نیاز است به همین علت از ATP نیز به همراه LPS برای تحریک و فعال کردن DC ها(mDC) استفاده خواهیم کرد. در روز ششم، DC های گروه تیمار داروی گلیبوراید ( گلی بنکلامید) را خواهند گرفت. برای بررسی تمایز و فعال شدن DC های مشتق از مونوسیت ها، سلولهای کشت شده جمع آوری گردیده و سپس با استفاده از آنتی بادی کنژوگه با فلورسانس اختصاصی مارکر های CD11c، HLA-DR، CD14 و CD86 رنگ آمیزی شده و با تکنیک فلوسایتومتری بررسی خواهند شد. در نهایت از روش Real-time PCR برای بررسی بیان ژن فاکتور های التهابی و ضد التهابی در گروه mDCهای تیمار شده و نشده استفاده خواهد شد. هر دو گروه سلولهای دندریتیک تیمار نشده ( به عنوان گروه کنترل) و هم گروه سلولهای دندریتیک تیمار شده با گلیبوراید ( گلی بنکلامید) که کشت شده اند، جمع آوری گردیده و هر دو گروه از نظر مارکر های ذکر شده با فلوسیتومتری و همچنین بیان ژن های فاکتور های التهابی و ضد التهابی با Real-time pcr بررسی خواهند شد و بدین گونه اثرات دارو روی سلولهای تیمار شده با سلولهای کنترل به روش استاندارد مقایسه خواهند شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 71722 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی تاثیر تیمار با داروی گلیبوراید بر روی بیان فاکتور های التهابی و ضد التهابی در سلول های دندریتیک مشتق از مونوسیت |
| عنوان لاتین طرح | The study of Glyburide effect on the expression of inflammatory and anti-inflammatory factors in monocyte-derived dendritic cells |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | ایمونوتراپی بیماریهای شایع با استفاده از ژن درمانی |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | خیر |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | کارشناسی ارشد |
| مدت اجرا - ماه | 12 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | سلول های دندریتیک (DC) نقش ضروری در سیستم ایمنی و ارائه آنتی ژن و همچنین به خاطر انعطاف پذیری عملکرد در ایجاد پاسخ های ایمنی تحمل زا دارند و بنا به مطالعات فعال شدن NLRP3 اینفلامازوم و نهایتا عملکرد کاسپاز1 در DC ها منجر به تولید و آزادسازی سایتوکاینهای التهابی از جمله IL-1B و IL-18 از آنها می شود و چون گلیبوراید (گلی بنکلامید) یک NLRP3 inhibitor می باشد ما تاثیر تیمار آن را بر روی بیان فاکتورهای التهابی و ضد التهابی در سلول های DC مشتق از مونوسیت ها می سنجیم که بیانگر اثر ایمونوژن یا تولروژن DC ها در نتیجه تیمار با گلیبوراید (گلی بنکلامید) خواهد بود که به احتمال زیاد قادر خواهیم بود که با تیمار DC ها با گلیبوراید این مسیر NLRP3 را مهار نموده و DC های تولروژن ایجاد نماییم که در درمان بیماری های خود ایمنی می توانند مفید واقع شوند. |
| اهداف اختصاصی | بررسی امکان تولید سلول های DC از مونوسیت های حاصل از سلولهای تک هسته ای خون محیطی (PBMC) افراد سالم. -بررسی تاثیر داروی گلیبوراید بر روی تمایز، بلوغ و فعال شدن DC ها. -بررسی تاثیر داروی گلیبوراید بر روی بیان ژن های التهابی در سلولهای DC. -بررسی تاثیر داروی گلیبوراید بر روی بیان ژن های ضد التهابی در سلولهای DC. |
| چکیده انگلیسی طرح | Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) will be isolated using the Ficoll technique , then With MACS technique, we will separate monocytes by positive selection from other cells by anti-CD14 antibodies, so that other unlabeled cells (except monocytes) will exit the MACS column, but monocytes because of CD14 marker on their surface and binding to antibody against that, will remain attached to the beads in the column. Then we will collect monocytes from the column using buffer and piston in a tube. The obtained monocytes will be cultured in 6-well plates using RPMI-1640 containing 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 50 μM 2-mercaptoethanol, GM-CSF (40 μg/mL) and IL- 4 (20 µg/mL). The plates will be placed in a 37°C incubator with 5% CO2 and checked daily for contamination. On the third day, the cultures will be fed by removing half of the medium and replacing it with fresh RPMI-1640 containing 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 50 μM 2-mercaptoethanol, GM-CSF and IL- 4. On the sixth day, LPS (100 ng/mL) will be added to the culture medium and incubated for 24 hours to activate DCs and to activate NLRP3 in DCs, in addition to LPS (as the first signal), Extracellular Adenosine 5’ triphosphate (ATP) (as the second signal) is needed, for this reason, ATP will be used together with LPS to stimulate and activate DCs (mDC). In the treatment group, DCs will receive Glyburide on the sixth day. To evaluate the differentiation and activation of DCs derived from monocytes, the cultured cells are collected and then stained with antibodies conjugated with the specific fluorescence of CD11c, HLA-DR, CD14 and CD86 markers and analyzed by flow cytometry technique. Also, real-time PCR technique is utilized to investigate the gene expression of inflammatory and anti-inflammatory factors in treated and untreated mDC groups. Both groups of untreated dendritic cells (as a control group) and the group of dendritic cells treated with Glyburide that are cultured, will be collected and both groups will be evaluated in terms of the mentioned markers by flow cytometry as well as the expression of inflammatory and anti-inflammatory factors’ genes by Real-time PCR and thus the effects of Glyburide on treated cells will be compared with control cells with standard method. |
| کلمات کلیدی | DC های مشتق از مونوسیت های انسانی: سلول هایی هستند که در انسان، تحت شرایط التهابی، از مونوسیت هایی که CD14 را به میزان بالایی بیان می کنند، متمایز می شوند. گلیبوراید: گلیبوراید که با نام گلی بنکلامید نیز شناخته می شود از مشتقات سولفونیل اوره می باشد و در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 برای کنترل و کاهش سطح گلوکز خون استفاده می شود. NLRP3: (nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3) جزئی از کمپلکس اینفلامازوم است و به عنوان سنسور سیتوزولیکی عمل کرده و با شناسایی PAMP ها و DAMP ها نقش مهمی در پاسخ های ایمنی و التهابی ایفا می نماید. |
| ذینفعان نتایج طرح | بیماران مبتلا به خودایمنی |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| بهزاد برادران | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| توحید کاظمی | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| شیوا علی پور | دانشجوی مالک پایان نامه |
| جواد احمدیان هریس | مشاور |
| محمدرضا صادقی | مشاور |
| جواد معصومی | همکار اصلی |
| الهام باغبانی | همکار اصلی |
| بهار ناصری ممقانی | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر دندریتیک سلهای مشتق از مونوسیت های انسانی تیمار شده با گلیبوراید، ویژگی های تولروژنیک و اثرات ضد التهابی تقویت یافته ای را نشان دادند.متن خبر از آنجایی که نگهداری تولرانس نسبت به آنتی ژنهای خودی نقش مهمی در پیشگیری از وقوع بیماری های خودایمنی مانند دیابت نوع یک دارد و TolDC ها توانایی بالایی در القای تولرانس و تنظیم پاسخ دهی سلولهای T دارند، در این مطالعه دندریتیک سلهای مشتق از مونوسیت های انسانی را با گلیبوراید ( مهار کننده ی NLRP3) تیمار کرده و ویژگی های فنوتیپیک تولروژنیک، عملکردهای مهاری و ضدالتهابی ایجاد شده در این DC ها را با کاهش سطح بیان مارکرهای HLA-DR، CD86 و CD11c و همچنین کاهش سطح بیان سایتوکاین های التهابی اما افزایش سطح بیان سایتوکاین های ضدالتهابی این DC های تیمار شده نشان داد که حتی در حالت پالس شده با انسولین، اثرات ضدالتهابی تقویت یافته تری را نشان دادند. متعاقبا این DC ها با T سلهای اتولوگ مجاورت و هم کشتی داده شدند که مهار تمایز T سلها به سمت TH1 و به جای آن تمایز به سمت سلولهای TH2 و Treg با تغییر در سطح سایتوکاین ها و فاکتورهای رونویسی مربوطه نشان داده شد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
