تاثیر غلظت های مختلف کاربامایدپراکساید بر بیان ژن های مرتبط با اتوفاژی در سلول های بنیادی پالپ دندان انسان.
effect of different concentrations of carbamide peroxide on the expression of autophagy-related genes in human dental pulp stem cells
مجریان: مهدی رهبر , محمود بهاری
خلاصه روش اجرا: خلاصه روش اجرا: جهت انجام این تحقیق ، از پالپ وایتال دندان های شیری کودکان 6-11 ساله استفاده خواهد گردید. تیمار سلول های بنیادی با کاربامایدپراکساید و تعیین میزان IC50 با تست MTT: جهت مواجهه سلول های DPSCs با غلظت های مختلف کارباماید پراکساید، ابتدا 12000 سلول در هر خانه پلیت 96خانه ای ریخته و به محیط کشت DMEM Low Glucose حاوی 10% FBS و آنتی بیوتیک اضافه خواهد شد تمام سلول ها به جز کنترل، با غلظت های کارباماید پراکساید μm/mL 10،15،20،25 مجاور خواهند شد. سپس پلیت به داخل انکوباتور 37 درجه CO2 دار منتقل و به مدت 24 ساعت انکوبه خواهد گردید. سپس میزان سمیت کاربامایدپراکساید بر روی سلول ها با استفاده از کیت MTT assay و بر اساس پروتکل شرکت سازنده کیت اندازه گیری خواهد شد. اندازه گیری بیان ژن مرتبط با اتوفاژی: بعد از تیمار سلول ها به مدت 24 ساعت با دوز های پایین تر از (IC50) Half maximal inhibitory concentration ، در ابتدا RNA Total سلول ها با استفاده از کیت استخراج RNA بر اساس پروتکل شرکت سازنده کیت استخراج خواهد شد.سپس RNA با استفاده از کیت تولید (Synthesis kit ) cDNA به DNA مکمل (cDNA ) تبدیل خواهد شد. در نهایت میزان بیان ژن های اتوفاژی ( p62، Beline-1، LC3) با استفاده از تکنیک Real time PCR مورد بررسی قرار خواهند گرفت . تمامی تست ها به صورت سه بار تکرار انجام شده و گروهی که کاربامایدپراکساید دریافت نمی کند به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته می شود. تمامی نتایج به دست آمده از گروه های تیمار شده ، با گروه کنترل مقایسه خواهد شد . نتایج به صورت شاخص های توصیفی گزارش خواهد شد. مقایسه بیان ژن قبل و بعد از مواجهه با هریک از غلظت های کاربامایدپراکساید در گروه القا کننده و مهار کننده ، توسط آزمون تی تست ( توزیع نرمال داده ها) و یا آزمون عدم توزیع نرمال داده ها بررسی خواهد شد. برای تجزیه تحلیل داده ها ازآزمون آماری one way ANOVA استفاده خواهد شد.مقدار احتمال کمتر از 05/. به عنوان سطح معنی دار در نظر گرفته خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا در دانشکده/مرکز |
| کد طرح | 68858 |
| عنوان فارسی طرح | تاثیر غلظت های مختلف کاربامایدپراکساید بر بیان ژن های مرتبط با اتوفاژی در سلول های بنیادی پالپ دندان انسان. |
| عنوان لاتین طرح | effect of different concentrations of carbamide peroxide on the expression of autophagy-related genes in human dental pulp stem cells |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | آینده پژوهی و پژوهش عملیاتی در نظام سلامت |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | دکتری عمومی |
| مدت اجرا - ماه | 6 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | نوآوری و ضرورت اجرای طرح: با توجه به اینکه اتوفاژی نقش مهمی در خودنوزایی و تمایز سلول های بنیادی دارد، لذا شناخت مواد موثر در اتوفاژی مزایایی درمانی برای طیف وسیعی از بیماری ها دارد. لذا نتایج این طرح نشان خواهد داد که آیا کارباماید پراکساید (غلظتهای مختلف این ماده ) خواهد توانست با تنظیم اتوفاژی، باعث افزایش پتانسیل بقا و تمایز ادنتوژنیک سلول های بنیادی پالپ دندان شود. یکی از مزیت های مهم این روش، ایمن بودن آن است که در آن سلول بنیادی از نظر ژنتیکی دست ورزی نمی شود و این که می توان این روش را بدون خطر در طب بالینی نیز استفاده کرد. 3- مقدمه، بیان مسئله و ضرورت اجرای طرح: اتوفاژی (Autophagy) به عنوان یک فرآیند حیاتی در سلول شناخته می شود که در تکامل زیستی، سیستم ایمنی و مرگ سلولی نقش ایفا می کند(1). اتوفاژی مسئول بازیافت ماکرومولکول ها برای تولید انرژی داخل سلولی و نوسازی در درون سلول است . اتوفاژی دارای عملکردی دوگانه می باشد، از یک طرف باعث افزایش مدت و میزان بقای سلول و از طرف دیگر در مراحل پیشرفته ،باعث مرگ سلول می شود(2). با این که ممکن است به نظر برسد اتوفاژی روندی مخرب است اما این مکانیسم طبیعی دفاع سلول است(3). در مواقعی که مواد غذایی به اندازه کافی به سلول نمیرسد یا اینکه سلول باید عوامل مهاجم مثل باکتری و ویروس را تخریب کند، اتوفاژی برای زدودن مواد زائد و کاهش مصرف سلول ضروری است. علاوه بر این سلول ، مواد زائدی را که خود تولید کرده یا اجزایی را که پیر شدهاند به این ترتیب تخریب کرده و از مواد اولیه آنها برای تولید اجزا و مواد جدید استفاده میکند(4). گزارش شده است که اتوفاژی سلول های بنیادی را تحت محرک های زیستی، گرسنگی، هیپوکسی، استرس های اکسیداتیو و پیری سلولی تنظیم می کند. استرس های اکسیداتیو که از عوامل اصلی در مرگ زودرس سلول های بنیادی می باشند، اتوفاژی را القا می کنند(5). یکی از این مواد اکسیداتیو ،کارباماید پراکساید است که در پروسه بلیچینگ مورد استفاده قرار می گیرد (6). کارباماید پراکساید یک عامل قابل قبول برای سفیدکردن دندان ها در خانه تحت نظارت دندانپزشک است که به صورت ژل به قسمت خارجی سطح دندان اعمال میشود.(7) در گذشته کاربامایدپراکساید 10درصد به عنوان استاندارد تکنیک بلیچینگ خانگی درنظر گرفته میشد.(8) کاربامایدپراکساید یک مشتق پراکسید هیدروژن است که با اوره پیوند دارد، همچنین به عنوان پراکسید هیدروژن اوره شناخته می شود، همچنین به عنوان یک عامل اکسید کننده سبز در سنتز آلی استفاده می شود و به عنوان عامل ضد عفونی کننده یا سفید کننده در لوازم آرایشی و دارویی کاربرد دارد.(9و10) کارباماید پراکساید، با نام شیمیایی پراکساید هیدروژن اوره ،ترکیبی آنتی سپتیک می باشد که به دلیل توانایی آزاد کردن اکسیژن، در سفید کردن دندان کاربرد دارد (11). این دارو به طور وسیعی در درمان تغییر رنگهای دندانی مورد استفاده قرار می گیرد. کاربرد کارباماید پراکساید برای سفید کردن خارجی با درجات مختلفی (معمولا کم) در دندان و مخاط اطراف صدمه ایجاد می کند (12). در تایید این موضوع Matsui نشان دادند که استرس های اکسیداتیو می توانند باعث القای اتوفاژی شوند (13). سلول های بنیادی پیوندی نمی توانند در محیط ایسکمیک پیوند که سرشار از رادیکال های آزاد اکسیژن و سایتوکاین های التهابی می باشد، به مدت زیادی دوام بیاورند و در همان روزهای ابتدایی قسمت اعظم سلول های بنیادی دچار مرگ سلولی می شوند که کارایی شان را در درمان سلولی بسیار محدود می کند. برای افزایش کارایی، درمان مؤثر نیاز است تا سلو ل های بنیادی را در برابر این شرایط سخت مقاوم کرده و مدت بقای این سلول ها را در محیط پیوند افزایش دهیم (14). یکی از روش هایی که در طی چند سال اخیر توجه بسیار ویژه ای به آن شده است ، استفاده از روش پیش شرطی کردن با عوامل مختلف از قبیل هیپوکسی، عوامل شیمیایی ، فاکتورهای رشد و دیگر عوامل می باشد که اثرات بسیار سودمندی در محافظت سلولی دارد (15). در این روش سلول را با غلظت های بهینه عوامل مختلف( کارباماید پراکساید، هیدروژن پراکساید و ...) به طور دوره ای مواجه می کنند که باعث می شود بیان ژن های بقا و محافظت کننده سلولی در سلول افزایش یابد، سلول را در برابر عوامل زیانبار در محیط پیوند حفظ کنند و بقای سلول پیوندی به میزان زیادی افزایش یابد که در نتیجه آن ،کارایی پیوند سلول بنیادی به میزان بسیار زیادی افزایش می یابد (15). یکی از مزیت های مهم این روش، ایمن بودن آن است که در آن سلول بنیادی از نظر ژنتیکی دست ورزی نمی شود و این که می توان این روش را بدون خطر در طب بالینی نیز استفاده کرد.(16). Teti و همکاران در سال 2015 نشان دادند که درمان HEMA به وضوح باعث ایجاد اتوفاژی و سپس آپوپتوز در فیبروبلاست لثه انسانی می شود در حالی که عدم وجود هیچ گونه نشانه ای از فعال سازی اتوفاژی در فیبروبلاست های در معرض TEGDMA مشاهده می شود(18). این داده ها نشان می دهد که سلول ها به استرس ناشی از تومونومر با القای متفاوت مکانیسم های سازگار برای حفظ هموستاز سلولی پاسخ می دهند(17و18). Llena و همکاران در سال 2019 در بررسی انتشار، سمیت سلولی و واکنشهای التهابی در سلولهای بنیادی پالپ دندان انسان به چهار محصول سفید کننده ی تجاری نشان دادند که غلظت بالایی از گونه های اکسیژن واکنش پذیر( ROS) در داخل سلول های بنیادی پالپ دندان انسان بعد از قرار گرفتن در معرض Opal-HP (ژل سفید کننده تجاری حاوی پراکسید هیدروژن)، گزارش شد. در نهایت با Opal-Hp در پالپ کرونال و رادیکولار نکروز شدید مشاهده شد. غلظت های مشابه از پراکسید هیدروژن و پراکسید کارباماید در انواع محصولات سفید کننده، پاسخ های متفاوتی را در سلول ها و بافت پالپ دندان ایجاد می کنند، این موضوع نشانگر این است که محصولات سفید کننده حاوی عوامل ناشناخته ای هستند که می توانند بر سمیت آنها تأثیر گذارد(19). لیکن تاکنون درخصوص نقش اتوفاژی در فرآیند مرگ سلولی توافقی حاصل نشده است و ناهمگونی در نتایج بسیاری از مطالعهها بحثبرانگیز بوده است. هدف از مطالعه حاضر بررسی تاثیر کاربامیدپراکساید به عنوان یک عامل اکسیداتیو در راه اندازی فرایند اتوفاژی در سلول ها بنیادی می باشد. در صورتیکه این ماده باعث تحریک اتوفاژی شود می توان نتیجه گرفت که استفاده از آن در بلیچینگ یک راه کار درمانی ایمن بوده و همچنین اثرات حفاظتی در برابر مرگ سلولی در سلول های بنیادی نیز دارد. با توجه به عدم اجرای مطالعه ای در زمینه تاثیر کارباماید پراکساید بر اتوفاژی سلول های پالپ دندان، مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر غلظت های مختلف کارباماید پراکساید بر بیان ژنهای مرتبط با اتوفاژی در سلول های بنیادی پالپ دندان انسان انجام خواهد شد. |
| اهداف اختصاصی | تعیین و مقایسه میزان سمیت سلولی در مواجهه با غلظت های مختلف کارباماید پراکساید با استفاده از تست MTT -سنجش بیان ژن هایBecline-1, P62, LC3 در مواجهه با غلظت های متفاوت کاربامایدپراکساید با PCR |
| چکیده انگلیسی طرح | Vital pulp of deciduous teeth in children aged 6-11 years will be used for this study. Treatment of Stem Cells with Carbamide peroxide and Determination of IC50 by MTT Test: To treat DPSCs with Carbamide peroxide, firstly 1200 cells will be seeded in each well of a 96-well plate containing DMEM low glucose culture media with FBS 10%. Then the plate will be transferred into a 37° CO2 incubator for 24 hours. The cells will treat with 10, 15, 20, and 25% Carbamide peroxide concentrations and incubated for 24 hours. Then Carbamide peroxide toxicity on the cells will be measured using the MTT assay kit according to the protocol of the manufacturer. After treating cells for 24 hours with doses lower than Half maximal inhibitory concentration (IC50), RNA Total of the cells will get extracted using RNA extraction kit according to manufacture protocol. The RNA will then be converted to complementary DNA (cDNA) using a cDNA synthesis kit. Finally, the expression of the autophagy genes ( LC3 , Becline-1 , p62) will be measured by the Real-time PCR technique. All tests are repeated three times and the group that does not receive Carbamide peroxide is considered as the control group. All results obtained from the treated groups will be compared with the control group. |
| کلمات کلیدی | تست MTT : یکی از روشهای تست سمیت سلولی برای سنجش میزان مرگ سلولی روش MTT است که مبنای آن تشکیل رنگ فورمازان با احیا ماده MTT (دی متیل تیازول ۲ و ۵ دی فنیل تترازولیوم برمید) و یا سایر نمکهای تترازولیوم است. با گسستگی حلقه تترازولیوم MTT توسط آنزیمهای میتوکندریایی در سلولهای زنده، کریستالهای فورمازان بنفش رنگ نامحلول تشکیل میشود. تشکیل این کریستالها نشان دهنده فعال بودن آنزیمهای زنجیره تنفسی و معیاری برای زنده بودن سلولها است. با اندازه گیری میزان جذب توسط اسپکتوفتومتر در طول موجهای مشخص میتوان تعداد سلولهای زنده را تعیین کرد. این آزمون بر اساس استاندارد ISO 10993-5 انجام شده و هدف آن ارزیابی برون تنی سمیت سلولی میباشد.(20) سلولهای بنیادی پالپ دندان: سلولهای بنیادی پالپ دندان (DPSCs) ، سلولهای بنیادی موجود در پالپ دندان هستند که همان بافت زنده نرم در دندانها است. این سلول ها پلوری پوتنت هستند می توانند در شرایط in vitro به بافت هایی که خصوصیات مشابه لایه های مزودرم ، اندودرم و اکتودرم دارند ، تمایز یابند.(21) هدروژن پراکساید: هیدروژن پراکساید - اوره ترکیبی است که شامل مقادیر متناسب و مساوی از هیدروژن پراکساید و اوره است. این ترکیب به صورت کریستال جامد سفید رنگ میباشد . این ماده با حل شدن در آب، هیدروژن پراکساید تولید میکند. غالباً این ترکیب در مباحث دندان پزشکی، با نام کاربامید پراکساید شناخته میشود و از آن به عنوان منبعی برای تولید هیدروژن پراکساید جهت بلیچینگ (سفید کردن)، ضدعفونی کردن و اکسید کردن استفاده میشود. (6). اتوفاژی(Autophagy): مسیر حیاتی مورد نیاز برای بقاء سلول در طول گرسنگی از طریق خودخوری و تخریب پروتئین ها و اندامک های سلولی می باشد(22). |
| ذینفعان نتایج طرح | با توجه به استفاده ی گسترده از سلولهای بنیادی پالپ دندان در پزشکی بازساختی ،نتایج این مطالعه می تواند در ارائه پروتکل های درمانی بیماران کمک کننده باشد. |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| مهدی رهبر | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| محمود بهاری | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| کاظم نجاتی کشکی | مشاور |
| سیده مرضیه حسینی چورسی | دانشجوی مالک پایان نامه |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
