طراحی فرمولاسیون جدید نانو آنتی اکسیدانتی آستاگزانتین و ارزیابی تاثیر فرمولاسیون آن بر سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در محیط اکسیداتیو در شرایط in vitro
Design of a new nano-antioxidant formulation of astaxanthin and evaluation of its effect on bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro
مجریان: مرضیه فتحی
خلاصه روش اجرا: میسل های بر پایه CS-g-PLA برای بارگذاری آنتی اکسیدان سنتز و شناسایی خواهند شد. برای سنتز CS-g-PLA ، برای بهبود حلالیت کیتوزان در حلال آلی ، کمپلکس کیتوزان با سدیم دودسیل سولفات (SDS) به سادگی با مخلوط کردن محلولهای اسیدی CS و SDS تهیه خواهد شد. مقادیر از پیش تعیین شده کیتوزان و SDS به ترتیب در 120 میلی لیتر محلول استیک اسید 2 درصد حل خواهد شد. مخلوط را به آرامی به مدت 3 ساعت در دمای اتاق هم بزنید. سپس سانتریفیوژ و رسوب حاصله ، سه بار با آب مقطر شسته شده و در نهایت فریزدرای می شوند تا یک محصول سفید و اسفنجی (scc) به دست آید. در ادامه مقدار مشخصی از SCC و لاکتید که در خلا نگهداری می شدند در DMSO خشک در دمای 86 درجه سانتی گراد حل شده و تری اتیل آمین به عنوان کاتالیزور استفاده می شود. مخلوط تحت گاز نیتروژن در دمای 85 درجه سانتیگراد به مدت 10 ساعت با همزن مغناطیسی هم زده می شود تا در نهایت یک محلول شفاف تهیه شود. محلول حاصله به بافر تریس (PH 8) اضافه شد. تا زمان تشکیل سه فازتحت شرایط همزن مغناطیسی قرار داده می شوند. سپس سانتریفیوژ انجام می شود. محلول به دست آمده به ترتیب از طریق رسوب گذاری با بافر تریس و شستشو با آب مقطر خالص شد و در نهایت با فریز داری خشک می شوند. ساختارهای شیمیایی کوپلیمرها با طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-IR) ، رزونانس مغناطیسی هسته ای تأیید می شوند. در این پروژه از این نانوحامل سنتز شده برای بارگزاری و حمل داروی آستاگزانتین استفاده خواهد شد. بدین صورت که آستاگزانتین و نانوحامل سنتز شده را با نسبت 2/10 به 2 سی سی تتراهیدروفوران (THF) اضافه خواهد شد و جهت همزدن بوسیله مگنت بر روی دستگاه هیتر استیرر به مدت 24 ساعت قرار خواهدگرفت. در پایان 1 سی سی از داروی بارگزاری شده در نانوحامل را به کمک سر سرنگ به آرامی به 10 سی سی اب مقطر تحت همزن بالا اضافه می شود. سپس تا زمان تبخیر کامل تتراهیدروفوران (THF) تحت همان شرایط همزن بالا قرار خواهد گرفت. سپس میزان داروی انباشته شده و لود شده در فرمولاسیون بهینه محاسبه خواهد شد.در ادامه آثرات کاربردی آن در شرایط in vitro مورد بررسی قرار می گیرد. سلول های بنیادی مغز استخوان از مرکز تحقیقات نانو فناوری دارویی تبریز تهیه خواهد شد. کشت سلول های تهیه شده در محیط RPMI1606 در شرایط دی اکسید کربن 5% و نیز 37 درجه سانتیگراد در فلاسک های کشت انجام خواهد شد.ابتدا به منظور پیدا نمودن IC50 پراکسیدهیدروژن تست MTT انجام خواهد شد. سپس برای اثربخشی آستاگزانتین پوشش دهی شده غلظت های مختلف آن تهیه شده و در پلیت 96 تایی ، اعمال خواهند شد . و در ادامه سلول ها تحت استرس ( IC50 H2O2) تعیین شده قرار خواهند گرفت تا غلظت موثر آستاگزانتین پوشش دهی شده تعیین گردد. قابل ذکر می باشد که سلول های تیمار شده تنها با پراکسید هیدروژن بعنوان کنترل مثبت و سلول های بدون هیج گونه تیمار و پیش تیمار بعنوان کنترل منفی در کنار پیش تیمار و تیمار ها کشت داده خواهند شد. با غلظت اثر بخشی تعیین شده به کمک تست MTT دوبار در پلیت های 6 خانه ای سلول ها پیش تیمار و تیمار شده و به منظور نشان دادن آپوپتوز سلول ها بوسیله پراکسید هیدروژن و اثرات بازدارندگی آستاگزانتین پوشش دار از تست های فلوسایتومتری و رنگ آمیزی DAPII استفاده خواهد شد و با میکروسکوپ فلورسنت عکس برداری خواهند شد. همچنین برای اندازه گیری گونه های فعال اکسیژن از روش CFC استفاده خواهد شد . به منظور مطالعات مولکولی استخراج RNA انجام خواهد شد. سنتز cDNA تک رشته ای با استفاده از آنزیم MMLV طبق پروتکل های موجود صورت خواهد گرفت. به منظور انجام Real time PCR طراحی پرایمر بر روی ژنهای مرتبط با رشد سلولهای مورد نظر یعنی ژنهای HO-1 ,NQOIو نیز ژن NRF2 توسط نرم Oligo 7 انجام خواهد شد و برای سنتز به شرکت تکاپو زیست ارسال خواهد شد، واکنش Real time PCR به صورت تکرارهای 3 تایی (triplet) صورت خواهد گرفت. در این مطالعه سعی خواهد شد پس از آنالیز داده ها توسط فرمول ارائه شده توسط pfaffl و همکارانش تاثیر آستاگزانتین حامل دار بر روی میزان بیان ژنهای مرتبط با رشد سلولهای بنیادی و نیز استرس اکسیداتیو ناشی از سلول های بنیادی بررسی شود. همچنین از ژن GAPDH بعنوان ژن خانه دار به منظور نرمالایز نمودن داده های حاصل استفاده خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 68244 |
| عنوان فارسی طرح | طراحی فرمولاسیون جدید نانو آنتی اکسیدانتی آستاگزانتین و ارزیابی تاثیر فرمولاسیون آن بر سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در محیط اکسیداتیو در شرایط in vitro |
| عنوان لاتین طرح | Design of a new nano-antioxidant formulation of astaxanthin and evaluation of its effect on bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro |
| نوع طرح | طرح تحقیقاتی |
| اولویت طرح | توسعه فناوریهای نوین برای دارورسانی |
| نوع مطالعه | مطالعه برای ساخت دارو یا وسائل |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | خير |
| مقطع پایان نامه | |
| مدت اجرا - ماه | 10 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | در دهه اخیر علاقه وافری به مطالعه و پژوهش بر روی ترکیباتی که می توانند اثرات موثری بر اهداف ملکولی در بیماری های مختلفی داشته باشند بوجود آمده است. بسیاری از فرایندهای سلولی شامل متابولیسم سلولی، مسیرهای انتقال پیام، مسیرهای تنظیم بیان ژن، تکثیرسلولی و همچنین مرگ برنامه ریزی شده سلول تحت استرس اکسیداتیو قرار می گیرند. رادیکالهای آزاد و دیگر انواع اکسیژن باز فعال بهطور مداوم در طی فرآیندهای فیزیولوژیک طبیعی و همچنین در وضعیتهای پاتولوژیک تولید میشوند که توسط سیستم آنتی اکسیدانت ذاتی بدن با مکانیسمهای آنزیمی و غیر آنزیمی بهشکل غیر فعال در میآیند اما در شرایطی مانند آنچه در هنگام بیماریها اتفاق میافتد تعادل بین رادیکالهای آزاد و مکانیسمهای آنتی اکسیدانت بدن بههم میخورد. لذا استفاده از آنتی اکسیدانتهای کمکی میتواند به بهبود یا توقف روند بیماری کمک کنند. ترکیباتی که دارای خواص آنتی اکسیدانی هستند از نظر ساختاری و وجود گروه های هیدروکسیل و تعداد آنها متفاوت هستند که منجر به تفاوت آنها در فعالیت آنتی اکسیدانی آنها شده است. آستاگزانتین یک ترکیب نارنجی پررنگ دارای فعالیت غیر معمول وبسیار قوی انتی اکسیدانی می باشد که تاثیر زیادی روی سلامت انسان دارد به عنوان مثال می توان به پیشگیری از بیماریهای قلبی -عروقی ،تقویت سیستم ایمنی بدن ،جلوگیری از انواع سرطانها ودرمان آنها و روند پیرشدن سلولها اشاره کرد. استفاده مستقیم ازآنتی اکسیدان ها موجود بعلت ماهیت آبگریز و پایداری پایین مقدور نمی باشد. تحقیقات قابل توجهی در زمینه توسعه نانو ذرات موثر در سیستم های انتقال دارو با تخریب پذیری زیستی وجود دارد. تثبیت دارو در یک بستر و حامل مناسب روش مناسبی را برای پایداری، ذخیره سازی یا عرضه مداوم دارو ارایه می دهد. نانوتکنولوژی توانایی کنترل ماده در مقیاس اتمی و مولکولی است و از ویژگیهای مفید نوظهور در این بعد در علوم مختلف استفاده می شود. حوزه پژشکی از این تکنولوژی بسیار بهره برده و نمونه بارز آن معرفی انواع نانو ذرات بعنوان سیستم های دارورسانی و در کل سامانه رهایش می باشد. حوزه کاربردی نانوتکنولوژی فقط به این شاخه محدود نشده و موارد متعددی را در بر می گیرد. اگر خواسته باشیم یکی از ویژگیهای کلی این سامانه ها رو ذکر کرده باشیم توانایی آنها در کپسوله کردن و حفاظت از محتویات خود تا رسیدن به جایگاه هدف و در مورد آنتی ژن ها عرضه آنها به سلول های حرفه ای ارائه دهنده آنتی-ژنی می باشد. نانوذرات پلیمری نانوذرات زیست تخریبپذیر پلیمری جهت بهبود مقدار درمانی داروهای مختلف محلول/نامحلول در آب و ملکولهای زیست فعال با بهبود دسترسپذیری زیستی، حلالیت و زمان نگهداری استفاده شدهاند. این فرمولاسیون دارو-نانوذرات هزینههای بیمار و خطر سمیت را کاهش میدهند. نانوکپسوله کردن داروهای پزشکی (نانوپزشکی)، اثر دارو، ویژگی، تحمل پذیری و شاخص درمانی داروها را افزایش میدهد. نانوحاملهای پلیمری در مقایسه با داروهای آزاد میتوانند مزایای زیادی داشته باشند: - دارو را از تخریب زود هنگام محافظت میکنند؛ - از واکنش زود هنگام دارو با محیط بیولوژیکی جلوگیری میکنند؛ - جذب داروها به درون بافتهای انتخابی (بطور مثال تومور جامد) را افزایش میدهند، - پروفایل سینتیک دارویی و توزیع بافتی دارو را کنترل میکنند و نفوذ درون سلولی را بهبود میبخشند. نانوذرات پلیمری میتوانند برای کپسوله کردن ملکولهای دارویی کوچک آبدوست و آبگریز و ماکروملکولها کپسوله شوند. این نانوذرات میتوانند برای رهش داروی کپسوله شده با سرعت کنترل شده از طریق فرسایش سطحی یا تودهای و یا تورم حاصل از انتشار در رفتار وابسته به زمان و یا شرایط استفاده شوند. سرعت رهش میتواند توسط اصلاح زنجیر جانبی پلیمر، توسعه پلیمرهای جدید و یا سنتز کوپلیمرها کنترل شود. در حالت کلی سیستمهای پلیمری زیستتخریب پذیر میتوانند سطح دارو را در محدوده بهینه در مدت زمان طولانیتری در مقایسه با دیگر روشهای رهش دارو تامین کنند. بنابراین این روش درحالیکه توانایی استفاده از داروهای بسیار سمی، کم محلول و یا نسبتاً ناپایدار را بالا میبرد، تاثیر دارو و رضایت بیمار را نیز افزایش میدهد. پلی¬(D،L-لاکتاید) و پلی¬(گلیکولید) و کوپلیمرهای¬¬ آنها، پلی(D،L-لاکتاید-کو-گلیکولید)(PLGA)، پلی کاپرولاکتون، پلی آلکیل سیانوآکریلات، کیتوسان، ژلاتین متداولترین پلیمرهای زیست تخریبپذیر استفاده شده برای رهش کنترل شده دارو هستند و بطور وسیعی بررسی شدهاند. روش درمانی شیمیایی، اگرچه یک روش روتین در درمان بیماری های سرطان استفاده می شود، اما دو محدودیت عمده دارد. یکی اثرات و عوارض جانبی ناشی از ایجاد استرس اکسیداتیو توسط داروهای شیمی درمانی است که باعث آپوپتوز سلول های نرمال و یا بنیادی می گردد و دوم اینکه برخی سرطان ها نه تنها با استرس اکسیداتیو از بین نمی روند بلکه به علت ورود به درمانسی از دسترس دارو خارج می گردند. بنابراین در این مطالعه میزان و تاثیر آنتی اکسیدان ها با تاکید بر آستاگزانتین به عنوان سلطان آنتی اکسیدان ها و نانوفرمولاسیون آنها با نانوذرات پلیمری در شرایط in vitro بررسی خواهد شد . به منظور بررسی مکانیسم تاثیر آنتی اکسیدان های بکار رفته مسیر سیگنالینگ NrF2 بررسی خواهد شد . مسیر سیگنالینگ NrF2 Nrf2 فاکتور رونویسی متعلق به خانواده پروتئینی ژیپ لوسینی بازی (bzip) است و توسط ژن NFE2L2 کد می شود. Nrf2 درهمه بافتها بیان می شود اما بیشتر آن در مغز، کلیه، ماهیچه، شش، قلب و کبد می باشد. Nrf2 پروتئینی شامل 605 اسید آمینه و دارای شش ناحیه بسیار حفاظت شده بنام دومین های Neh می باشد. دومین Neh1 به Nrf اجازه هترودایمر شدن با پروتئین های کوچک MAF را می دهد . دومین Neh2 به اتصال Nrf2 به پروتئین های سرکوبگر Keap1 کمک می کند. Neh3 احتمالا نقشی در پایداری پروتئین Nrf2 بازی می کند. ممکن است به عنوان یک دومین فعال کننده رونویسی فعالیت کند. دومین Neh4,Neh5 به پروتئین اتصال یابنده به عنصر پاسخ( cAMP (CRE متصل می شود و رونویسی از ژنهای هدف Nrf2 را فعال می کند. ناحیه Neh6 موجب تجزیه شدن این فاکتور می شود . تحت شرایط هموستاتیک و بدون استرس Nrf2 در داخل سیتوپلاسم به پروتئین سرکوبگر Keap1 متصل است و موجب تخریب پروتئوزومی آن می شود.که به این طریق فعالیت و انتقال آن به هسته مهار می شود. به محض مواجه با گونه های فعال اکسیژن (ROS) فاکتور Nrf2 از مهارکننده Keap1 جداشده و در سیتوپلاسم انباشته و باعث انتقال آن به هسته می شود. و در آنجا به ARE در ناحیه پروموتور ژنهای کد کننده آنزیم های آنتی اکسیدان متصل می شود. و تولید آنزیم های آنتی اکسیدان فازІІ را القا می کند. این آنزیم ها شامل , UDP-glucuronosyltransferase (UGTs) , Glutamate-cysteine ligase catalytic subuni، heme oxygenase (HO) NAD(P) ، dehydrogenase quinine(NQO1) و غیره می باشند که در مقابله با(ROS) نقش مهمی ایفا می کنند. |
| اهداف اختصاصی | فرمولاسیون آنتی اکسیدان( آستاگزانتین،...) با پوشش­های قابل تزریق به منظور کاهش استرس اکسداتیو-تعیین تاثیر نانوحامل حاوی آنتی اکسیدان بر کاهش اثرات آپوپتوز سلول های بنیادی |
| چکیده انگلیسی طرح | Recent evidence has shown that bone marrow stem cells play vital roles in cell therapies of ischemia/hypoxia-damaged tissues. However, after transplantation, they might undergo apoptosis due to oxidative stress. Thus, recent strategies have been developed to support stem cells in harsh conditions, including pre-treatment with antioxidants. Of the various antioxidants, in this study, astaxanthin (ATX) was used to protect bone marrow stem cells against oxidative stress. Free radicals and other types of reactive oxygen species are continuously produced during normal physiological processes as well as in pathological conditions, which are inactivated by the body's innate antioxidant system with enzymatic and non-enzymatic mechanisms. But in situations like what happens during illness, the balance between free radicals and the body's antioxidant mechanisms is upset. Therefore, the use of adjuvant antioxidants can help improve or stop the disease process. Compounds that have antioxidant properties differ in structure and the presence of hydroxyl groups and their number, which has led to differences in their antioxidant activity. Astaxanthin is a bold orange compound with unusual and very strong antioxidant activity that has a great impact on human health. Direct use of available antioxidants is not possible due to their hydrophobic nature and low stability. The stabilization of the antioxidants in a suitable vehicle might be provided an appropriate platform for the sustainability, storage, and delivery of these molecules. Nanotechnology is the ability to control matter at the atomic and molecular scales, and use emerging features in this dimension is used in various sciences. The medical field has benefited a lot from this technology and a clear example of this is the introduction of various types of nanoparticles as drug delivery systems and the entire release system. If we want to mention one of the general features of these systems, their ability to encapsulate and protect their contents until they reach the target location. Therefore, the major objective of this study is to investigate the effects of ATX loaded in CS-g-PLA based micelles in protecting bone marrow stem cells in OS conditions. |
| کلمات کلیدی | استرس اکسیداتیو: وقتی که عدم توازون بین میزان تولید رادیکال های آزاد در بدن و سیستم دفاع آنتی اکسیدانی ایجاد می شود. آنتی اکسیدان: یکی ازمهمترین ریزمغذی های که مانع از جذب اکسیژن در بدن می شود. |
| ذینفعان نتایج طرح | در صورت حصول نتایج آزمایشگاهی مناسب و در ادامه با بررسی های بیشتر فرمولاسیون های بررسی شده میتوانند برای پیشگیری از بیماریهای مختلف در جامعه انسانی مورد استفاده قرار گیرد. |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| مرضیه فتحی | مجری اول (اصلی-هیات علمی) |
| علی موافقی | همکار اصلی |
| الهه دلیرعبدالهی نیا | همکار اصلی |
| حامیه گشتاسبی | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر نانوحامل های کیتوزان-پلی لاکتاید جهت رهش موثر آنتی اکسیدان آستاگزانین برای مبارزه با استرس اکسیداتیو تهیه و ارائه گردید.متن خبر استرس اکسیداتیو یک عامل کلیدی در بیماریهای مختلف است و بنابراین آنتیاکسیدانهای خارجی درمان مؤثری را می توانند ارائه کنند. در حالی که آستاگزانتین (ATX) یک آنتی اکسیدان طبیعی قوی است، حلالیت ضعیف آن در آب، پایین بودن فراهمی زیستی و ثبات، مانع از کاربرد موثر آن می شود. در این مطالعه یک سیستم دوگانه دوست بر پایه ی کوپلیمر کیتوزان/پلی لاکتاید در فرم نانومیسل با استفاده از یک استراتژی جدید سنتز و با تکنیک های مختلف شناسایی شد. ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی ATX بارگذاری شده در نانوسیتم سنتز شده نشان دهنده بهبود قابل توجهی در مقایسه با ATX آزاد بود. علاوه بر این، سمیت سلولی ATX میسلی روی سلول های مزانشیمی مغز استخوان تحت درمان با با هیدروژن پرااکسید مورد ارزیابی قرار گرفت که کاهش آپوپتوز و افزایش حفاظت توسط میسل های بارگذاری شده با ATX را در مقایسه با ATX آزاد نشان داد. این یافتهها نشان میدهند که میسلهای سنتز شده می توانند به عنوان نانوحاملهای امیدوارکننده برای تحویل ATX عمل کنند و پتانسیل آنتی اکسیدانی و محافظت از سلول های بنیادی در محیط های استرس اکسیداتیو را تقویت کنند. این رویکرد می تواند در درمان با سلول های بنیادی در بیماری های مرتبط با استرس اکسیداتیو موثر باشد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
