بررسی نقش سایتوکاین های مترشحه از سلول های بنیادی مزاشیمی بر القاء آپاپتوز در رده سلولی نوروبلاستوما

مجریان: راحله فرحزادی

خلاصه روش اجرا: در این طرح سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی از موسسه رویان و سلول های رده نوروبلاستوما (SH-SY5Y) از موسسه پاستور خریداری خواهد شد و پس از پاساژ و تکثیر سلولی، با استفاده از فلوسایتومتری شاخص های سطحی CD44 و CD73 به عنوان شاخص های مثبت و CD31 و CD34 به عنوان شاخص های منفی سلول های بنیادی مزانشیمی شناسایی می شوند. برای اثبات مزانشیم بودن سلول های بنیادی، علاوه بر قابلیت چسبندگی و بررسی مارکرهای سطح سلولی قید شده، این سلول ها به سلول های استخوان ساز و چربی ساز نیز تمایز داده می شوند که برای القاء و اثبات تمایز به سلول های چربی از محیط کشت آدیپوژنیک و رنگ آمیزی Oil Red و برای القاء و اثبات تمایز به سلول های استخوانی از محیط کشت استئوژنیک و رنگ آمیزی Alizarin Red استفاده خواهد شد. پس از آن آزمایش تعیین درصد زنده بودن سلول های رده سلولی نوروبلاستوما در حضور سلول های مزانشیمی با استفاده از آزمون MTT انجام می شود. بعد از تعیین درصد زنده بودن سلول های رده سلولی نوروبلاستوما، سلول های مزانشیمی حاوی فاکتورها و سایتوکاین های مترشحه به روش هم کشتی در معرض سلول های نوروبلاستوما قرار می گیرند و هم کشت می شوند. سلول های رده سلولی نوروبلاستوما تیمار شده با فاکتورهای مترشحه از سلول های مزانشیمی، جمع آوری شده و جهت انجام کارهای بعدی به چندین گروه تقسیم می شوند. گروه اول: جهت استخراج DNA و اندازه گیری طول تلومر به روش Real-time PCR، گروه دوم: جهت بررسی میزان آپاپتوز با اندازه گیری میزان بیان آنکسین-PI و کاسپاز-3 به روش فلوسایتومتری، گروه سوم: جهت استخراج پروتئین و بررسی میزان بیان پروتئین های bax و bcl2 به روش وسترن بلاتینگ و گروه چهارم: جهت بررسی نوع سایتوکاین های مترشحه از سلول های بنیادی مزانشیمی به روش الایزا نتایج با استفاده از تست آماری Anowa one-way و به کمک نرم افزار graphpad prismتجزیه و تحلیل خواهند شد.