تولید و مطالعه اثرات نانوذرات بارگیری شده با siRNA ضد STAT3 و داروی Dinaciclib بر روی میزان بقا و آپاپتوز رده های سلولی سرطانی
Production and study of the effects of nanoparticles loaded with anti-STAT3 siRNA and Dinaciclib on survival and apoptosis of cancer cell lines
مجریان: فرهاد جدیدی نیارق , هادی حسن نیا
خلاصه روش اجرا: این مطالعه دو فاز دارد: 1. تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات پگیله حاوی siRNA : ابتدا طی واکنشی با استفاده از پودرکیتوزان و اسید لاکتیک، ترکیب کیتوزان لاکتات تولید می شود. سپس پلی اتیلن گلیکول به ترکیب فوق اضافه و کیتوزان لاکتات پگیله ساخته می شود. بعد از پروسه پگ دار شدن، فولیک اسید به ترکیب مورد نظر اضافه می گردد. سپس باید نانوذرات RNA مداخله گر را در بر بگیرند. کیتوزان لاکتات پتانسیل بالایی برای کپسوله کردن siRNA و حفاظت از آن در برابر تخریب سرمی دارد. همچنین پلی اتیلن گلیکول باعث افزایش حساسیت غشا و بهبود فرایندهای غشایی در سلولهای سرطانی می شود. به علاوه سلول های سرطانی به میزان بالایی گیرنده ی فولیک اسید را بیان می کنند بنابراین فولات برای هدف قرار دادن این سلول ها مورد استفاده قرار می گیرد. تشکیل نانو ذرات ذکر شده در اثر تعاملات یونی بین کیتوزان لاکتات و siRNA حل شده در سدیم تری پلی فسفات ( siRNA/TPP ) صورت می گیرد. و نانوذرات حاوی siRNA تولید می شوند که خصوصیات فیزیکو شیمیایی آن ها بررسی می شود. تولید کمپلکس نانوذرات-siRNA با ژل اکتروفورز در ژل 2% آگارز تایید می شود و میزان بارگیری siRNA به صورت کمی بوسیله روش اولتراسانتریفیوژ بررسی خواهد شد. 2. مطالعه in vitro اثر بخشی نانو ذرات تهیه شده : از رده های سلولی سرطانی 4T1 (سرطان پستان) و CT26 (کولون) در این مطالعه استفاده خواهد شد که مطالعات گذشته تولید STAT3 و CDKs توسط آن ها را اثبات کرده است و میزان تولید آن نیز در هر رده سلولی متفاوت است. علت انتخاب رده های موشی سرطان پستان و کولون این است که در صورت نیاز به انجام تست های In vivo دسترسی به مدل های حیوانی موجود از جمله موش Balb/c امکان پذیر خواهد بود. این در حالی است که استفاده از رده های انسانی سرطان، نیازمند موش های nude می باشد که این مدل موش در دسترس نیست. این رده های سلولی در محیط RPMI1640 حاوی 10%fetal bovine serum و آنتی بیوتیک کشت داده می شوند. 1.2.مطالعه in vitro اثر بخشی درمان ترکیبی بر روی بقای سلول های سرطانی با روش MTT: ابتدا سلول های مذکور در پلیت 96 چاهکی کشت داده شده و انکوبه گردیدند. ۲۴ ساعت پس از کشت سلولی، نانوذرات حاوی siRNA ضد STAT3 و داروی مهارکننده CDKs (Dinaciclib) به محیط کشت هر رده سلولی اضافه گردید. تاثیر نانوذرات حاوی siRNA و دارو بر روی حیات سلولی توسط آزمون MTT ارزیابی می شود. 2.2. بررسی تاثیر درمان ترکیبی بر روی بیان ژن های هدف بوسیله آزمون Real-time PCR: بدین منظور سلول ها در پلیت های 48 خانه به صورت سه تایی کشت داده خواهند شد. پس از 24 ساعت با نانوذرات بارگیری شده با siRNA و دارو به مدت 48 ساعت دیگر تیمار خواهند شد و تاثیرات درمان تکی و ترکیبی بر روی بیان ژن STAT3 و CDKs و همچنین ژن های پیش برنده آپوپتوز، تکثیر، آنژیوژنز و متاستاز بوسیله آزمون Real-time PCR بررسی خواهد شد. 3.2. بررسی تاثیر گروه های درمانی بر روی بیان مولکول های هدف در سطح پروتئین بوسیله آزمون Western blot 4.2. بررسی تاثیر عوامل درمانی مختلف بر روی آپاپتوز سلول های سرطانی همچنین آنالیز فلوسیتومتری اپوپتوز با استفاده از Propidium Iodide (PI) /Annexin V بر اساس دستور العمل سازنده انجام خواهد شد و درصد سلولهای Annexin V /PI Positive با ارزیابی حداقل ۱۰۰۰۰ سلول تعیین خواهد شد، میانگین درصد سلولهای Annexin V /PI Positive و خطای استاندارد حداقل در دو آزمایش مستقل محاسبه خواهد شد. آنالیز چرخه سلولی با استفاده از رنگ آمیزی PI مخلوط (PI STAINING MIX ) انجام خواهد شد. 5.2. بررسی تاثیر گروه های درمانی مختلف بر روی مهاجرت سلول های سرطانی با استفاده از تست Scratch میزان مهاجرت (متاستاز) رده های سلولی با استفاده از تست Scratch مورد بررسی قرار خواهد گرفت.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 68137 |
| عنوان فارسی طرح | تولید و مطالعه اثرات نانوذرات بارگیری شده با siRNA ضد STAT3 و داروی Dinaciclib بر روی میزان بقا و آپاپتوز رده های سلولی سرطانی |
| عنوان لاتین طرح | Production and study of the effects of nanoparticles loaded with anti-STAT3 siRNA and Dinaciclib on survival and apoptosis of cancer cell lines |
| نوع طرح | گرنت - پایان نامه |
| اولویت طرح | ایمونوتراپی بیماریهای شایع با استفاده از ژن درمانی |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | دکتری عمومی |
| مدت اجرا - ماه | 14 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | طبق مطالعات انجام شده، مسیر پیام رسانی STAT3 که توسط مسیرهای فرا دست فراوانی تحریک می شود می تواند موجب رشد و تکثیر ، بقا ، تهاجم ، متاستاز ، رگزایی، مقاومت دارویی تومور و اختلال در مسیر آپوپتوز شود. بنابراین، مسدود کردن عملکرد STAT3 با استفاده ازمولکول siRNA منجر به کاهش چشمگیر مهاجرت ومتاستاز به ارگان های اصلی، مهار بیان پروتئین های آنتی اپوپتوتیک و افزایش آپوپتوز در سلول های سرطانی می شود. همچنین اختلال در کینازهای تنظیمی چرخه ی سلولی (CDKs) یکی دیگر از عوامل مهم تکثیر نامناسب مرتبط با تشکیل تومورهای سرطانی است. استفاده از داروی Dinaciclib به عنوان یک CDK inhibitor منجر به مهار عملکرد برخی از CDK های چرخه ی سلولی، جلوگیری از تکثیر سلولی، و القای اپوپتوز می شود. تا به حال موردی از این ترکیب درمانی گزارش نشده است. علاوه بر این مطالعات گذشته به دلیل سیستمیک بودن عوارضی به دنبال داشته اند. در این مطالعه ما برای اولین بار با استفاده از درمان ترکیبی متشکل از نانوذرات بارگیری شده با RNAهای مداخله گر ضد STAT3 و داروی Dinaciclib به عنوان مهار کننده CDKs به دنبال جلوگیری از رشد و تکثیر وآنژیوژنز سلول های توموری خواهیم بود. |
| اهداف اختصاصی | تولید نانو ذرات حاوی siRNA -مطالعه in vitro اثر بخشی درمان ترکیبی بر روی بقای سلول های سرطانی با روش MTT -بررسی تاثیر درمان ترکیبی بر روی بیان ژن های هدف بوسیله آزمون Real-time PCR -بررسی تاثیر گروه های درمانی بر روی بیان مولکول های هدف در سطح پروتئین بوسیله آزمون Western blot - بررسی تاثیر عوامل درمانی مختلف بر روی آپاپتوز سلول های سرطانی - بررسی تاثیر گروه های درمانی مختلف بر روی مهاجرت سلول های سرطانی با استفاده از تست Scratch |
| چکیده انگلیسی طرح | Studies have shown that the STAT3 signaling pathway, which is stimulated by abundant pathways, can lead to growth and proliferation, survival, invasion, metastasis, angiogenesis, tumor drug resistance, and apoptotic disruption. Thus, blocking the function of STAT3 using the siRNA molecule leads to a significant reduction in migration and metastasis to major organs, inhibition of antiapoptotic protein expression, and increased apoptosis in cancer cells. Disruption of cyclin-dependent kinases (CDKs) is another important factor in the Improper proliferation associated with cancer formation. The use of Dinaciclib as a CDK inhibitor may inhibit the function of some cell cycle CDKs, prevent cell proliferation, and induce apoptosis. No case of this combination therapy has been reported so far. In addition, past studies have had side effects due to their systemic nature. In this study, we will for the first time seek to prevent the growth, proliferation, and angiogenesis of tumor cells by using a combination therapy consisting of nanoparticles loaded with interfering RNAs against STAT3 and the drug Dinaciclib as an inhibitor of CDKs. |
| کلمات کلیدی | STAT3: یکی از اعضای خانواده STAT است که توسط ژن STAT3 تولید می شود. در سیتوپلاسم به صورت مونومر های غیر فعال وجود دارد که در پاسخ به سایتوکین ها و فاکتور های رشد توسط JAK فسفریله شده و تشکیل همودایمر می دهد و به هسته نقل مکان کرده و با اتصال به توالی های خاص نسخه برداری ژن های مربوطه را تحریک می کند. CDKs : Cyclin dependent kinases یا کینازهای وابسته به سیکلین و دسته ای از پروتئین های سرین ترئونین کیناز هستند که در پیشبرد و کنترل چرخه ی سلولی نقش اساسی دارند.CDKs بعد از اتصال به سیکلین فعال می شوند.در ساختار CDKs سه بخش اساسی وجود دارد:1) دومن N-terminal که غالبا از صفحات بتا ساخته شده است. 2) دومن C-terminal که غالبا مارپیچ الفا دارد. 3)سایت اتصال به ATP نانوذره (Nanoparticle) : ذراتی هستند که ابعاد آنها در حدود ۱ تا ۱۰۰ نانومتر است. لیپوزمها، درخت سانها، نانو ذرات پلیمری، نانو ذرات پوشش داده شده با پلیمرها، نانو ذرات کیتوزان و لستین و نانو ذرات دارویی نمونههایی از نانو ذراتی میباشند که برای دارو رسانی استفاده شده اند. کیتوزان: یک آمینو پلی ساکارید خطی و ترکیبی از پیوند های (۴→۱ β) واحدهای D-گلوکزآمین وN-استیل -D-گلوکزآمین است. کیتوزان توسط داستیلاسیون کیتین ( پلی ساکارید طبیعی و فراوان موجود در اسکلت خارجی سخت پوستانی همچون خرچنگ و میگو)، تهیه می شود. این پلی ساکارید کاتیونی به دلیل دسترس پذیری فراوان، چسبندگی بی نظیر، خواص دارویی مناسب و دیگرخواص سودمند بیولوژیکی مثل زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری، عدم سمیت و تحریک کم سیستم ایمنی، در موارد بیوپزشکی و دارویی مورد توجه گسترده قرارگرفته است. Polyethylene glycol :PEG یک ترکیب پلی اتر با کاربردهای صنعتی و پزشکی است و بسته به وزن مولکولی آن به polyethylene oxide (PEO) یا polyoxyethylene (POE) معروف است. ساختار PEG معمولاً به صورت H- (O − CH2 − CH2) n − OH بیان می شود. siRNA: RNA مداخله گر (RNAi) اصطلاح کلی است که به تکنولوژی خاموشی پس از رونویسی توسط RNA دو رشته ای اطلاق گردیده و در گیاهان با اصطلاح PTGS عنوان می شود .در تکنولوژیRNA مداخله گر (RNAi) ، رشته مکمل mRNA ژن مورد نظر ساخته شده و این رشته به mRNA ژن هدف متصل و یک توالی دورشته ای (dsRNA) را بوجود می آورد. از آنجا که سیستم سنتز پروتئین قادر به ترجمه mRNA دو رشته ای نمی باشد، بیان ژن هدف متوقف و اصطلاحاً ژن خاموش می شود. Dinaciclib: یک مهار کننده قوی برای CDK1,2,5,9 می باشد وباعث القای پسرفت تومورهای solid می شود. NF-kB: (فاکتور هسته ای kappa-light-chain enhancer از سلول های فعال شده ی B) پروتئینی است که کنترل پروتکل DNA، تولید سیتوکین و بقای سلول را بررسی می کند. NF-κB تقریبادرتمام سلول های حیوانی یافت می شود و در پاسخ های سلولی به محرک هایی همچون استرس، سیتوکین ها، رادیکال های آزاد، فلزات سنگین، اشعه ماوراء بنفش، LDL اکسید شده و آنتی ژن های باکتری یا ویروسی دخیل است. RAF/MEK/ERK : حضور میتوژن ها و عوامل رشد باعث فعال شدن تیروزین کیناز گیرنده های کانونی مانند EGFR وافزایش دینامیکی آنها و همچنین فعال شدن GTPase Ras می شود. این نتیجه منجر به فسفریلاسیون آبشار) MAPK (Raf-MEK-ERK و در نهایت باعث فسفریلاسیون و فعال شدن ERK می شود. فعالیت ERK برای فعال کردن ژن های تنظیم کننده ی سیکل سلولی مورد نیاز است. PI3K / AKT / MTOR: یک مسیر سیگنال داخل سلولی است که در تنظیم چرخه سلولی مهم است وبا تکثیر سلولی، سرطان و طول عمر مرتبط می باشد. P38 : یک پروتئین کیناز فعال با میتوژن (MAPK) است که به محرک های استرس مانند سیتوکین ها، اشعه ماوراء بنفش، شوک گرما و شوک اسموتیک واکنش نشان می دهد و در تمایز سلولی، آپوپتوز و اتوفاژی دخیل است. MCL-1: پروتئین کدگذاری شده توسط این ژن متعلق به خانواده Bcl-2 است. در این لوکوس جایگزینی اسپلایسینگ وجود دارد و دو ایزوفرم مشخص شناسایی شده است. ایزوفرم 1 با مهار آپوپتوز، بقای سلولی را بهبود می بخشد در حالی که محصول ژن کوتاه تر (ایزوفرم 2) اسپلایس شده، باعث افزایش آپوپتوز می شود. BCL-XL: این پروتئین عضوی از خانواده ی Bcl-2 است و از طریق جلوگیری از انتشار محتویات میتوکندری مانند سیتوکروم c به عنوان پروتئین ضد آپوپتوزی عمل می کند. |
| ذینفعان نتایج طرح | بیماران سرطانی و محققان حوزه سرطان. |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| فرهاد جدیدی نیارق | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| سپیده ایزدی | همکار اصلی |
| هادی حسن نیا | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| سارا بهاری | دانشجوی مالک پایان نامه |
| مجید احمدی | مشاور |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر مهار فاکتور STAT3 و کینازهای وابسته به سایکلین روشی موثر در درمان سرطان محسوب می شود.متن خبر خبر افزایش بیان فاکتورهای پیشبرنده تومور در ریزمحیط تومور یکی از مکانیسم های اصلی درگیر در رشد سلول های سرطانی و فرار آنها از پاسخ های سیستم ایمنی می باشد. در میان فاکتورهای متعددی که در رشد تومور نقش دارند، فاکتور نسخه برداری STAT3 و کینازهای وابسته به سیکلین (CDKs)نقش مهمی در تکثیر و بقای سلول های سرطانی ایفا می کنند. بنابراین، مهار این فاکتورها می تواند نقش موثری در مهار رشد سلول های سرطانی ایفا نماید. در این مطالعه به منظور انتقال مولکول های siRNA ضد فاکتور STAT3 و داروی Dinaciclib به سلول های سرطانی از نانوذرات زیست تجزیه پذیر بر پایه کیتوزان استفاده گردید. تاثیر این درمان ترکیبی در دو رده سلولی سرطانی موشی شامل 4T1 (سرطان سینه موشی) و CT26 (سرطان کولون موشی) ارزیابی گردید. نتایج این مطالعه نشان داد که مهار فاکتور STAT3 و CDKs می تواند بطور موثری موجب القای مرگ سلولی در سلول های سرطانی گردد. این یافته ها نشان داد درمان ترکیبی سرطان بوسیله مهار فاکتور STAT3 و CDKs می تواند به عنوان روشی نوین در درمان سرطان مطرح گردد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
