بررسی تاثیر تزریق وریدی c-kit+ بر روند آپوپتوز در بافت کلیه از طریق مسیر سیگنالینگ PI3K/Akt/GSK 3β و بیان Bax ، Caspase‑3 و Bcl2 در رتهای نر دیابتیک نوع 2
The effect of intravenous c-kit + injection on the process of apoptosis in renal tissue via PI3K / Akt / GSK 3β signaling pathway and Bax, Caspase ‑ 3 and Bcl2 expression in type 2 diabetic male rats
مجریان: فریبا میرزائی باویل , رعنا کیهان منش
خلاصه روش اجرا: در این مطالعه، 58رت نر با نژاد Wistar در محدوده وزنی 220-180 گرم طبق گروههای زیر (12 رت در هر گروه) مورد بررسی قرار خواهند گرفت: 10 حیوان به طور تصادفی ساده به منظور استخراج سلولهای بنیادی c-kit⁺ و c-kitˉ انتخاب شده و بقیه حیوانات به طور تصادفی ساده به گروههای زیر تقسیم می شوند: 1.گروه کنترل (C group):50 میکرولیتر محلول نرمال سالین را به صورت وریدی دریافت می کند. 2.گروه دیابتی( D group): گروه حیوانات دیابتی که 50 میکرولیتر محلول نرمال سالین را به صورت داخل وریدی دریافت میکند. 3. گروه دیابتی + سلول c-kit⁺ (D+c-kit⁺ group): 50میکرولیتر محلول نرمال سالین حاوی سیصد هزار سلول c-kit⁺ را به صورت وریدی دریافت میکند. 4.گروه دیابتی + سلول c-kitˉ (D+c-kit¯ group): 50میکرولیتر محلول نرمال سالین حاوی سیصد هزار سلول c-kit¯ را به صورت وریدی دریافت میکند. نحوه ی القای دیابت: برای القای دیابت نوع 2 مشابه انسانی، حیوانات در گروههای دیابتی با یک رژیم غذایی با چربی بالا شامل درصدهای مشخصی از مواد شامل: آرد گندم 10%، ساکارز 20%، چربی حاصل از دنبه گوسفند 31%، کازئین 25%، مخلوط ویتامین و مواد معدنی 6%، متیونین 3/0%، مخمر نان 1/0% و کلرید سدیم 1/0% به مدت یک ماه تغذیه شده و به دنبال آن یک تزریق داخل صفاقی استرپتوزوتوسین (35mg/kg) انجام خواهد شد . جهت تشخیص و تائید دیابت، سه روز بعد با ایجاد یک جراحت کوچک توسط لانست در دم حیوانات، یک قطره خون بر روی نوار گلوکومتری قرار داده شده و سپس توسط دستگاه گلوکومتر (Boehringer Mannheim Indianapolis,IN) نوار خوانده شده و قند خون بالای mg/dl 250 به عنوان شاخص دیابتی شدن در نظر گرفته میشود . برای تائید دیابت نوع دو تست تحمل گلوکز انجام خواهد شد. استخراج سلول های بنیادی C-kit+ و C-Kit- از مغز استخوان موش صحرایی: ابتدا 10 سر رت نر را با استفاده از دوز بالای کتامین (300mg/kg) و زایلازین (30mg/kg) کشته و استخوان های فمور حیوان را جدا می کنیم. استخوان ها را در محلول PBS حاوی 1% پنیسیلین و استرپتومایسین جهت جلوگیری از آلودگی قرار می دهیم و آن ها را به مرکز تحقیقات سلول های بنیادی انتقال می دهیم. قسمت های انتهایی استخوان را با استفاده از قیچی جدا کرده و با سرنگ 16 تا 18 و با محلول نرمال سالین استریل با تکنیک flushing محتویات مغز استخوان را داخل پلیت 10 سانتیمتری جمع آوری میکنیم. محتویات را به فالکون های 50cc منتقل کرده و پس از سانتریفیوژ با دور 1000-1500 rpm محلول رویی را دور ریخته و از سوسپانسیون ته نشین شده، سلول های تک هسته ای را با استفاده از محلولی به نام Ficoll-hypaque solution جدا می کنیم (سلول های c-kit+ در بین سلول های تک هسته ای قرار دارند). به این صورت که حجم های مساوی (2-3cc) از محلول فایکول و سوسپانسیون سلولی در فالکن 15cc میریزیم. سوسپانسیون را به آرامی و با زاویه 45-10 درجه به مایع اضافه می نماییم. سپس آن را با دور 400g و به مدت 20 تا 40 دقیقه سانتریفیوژ میکنیم. سلول های تک هسته ای بین محلول فایکول و فاز مایع قرار می گیرد که یک حالت شیری یا کدر دارد. این سلول ها را جدا کرده و چون فایکول خاصیت سمی دارد، سلول ها را شستشو می دهیم. به این طریق که محلول PBS را به این سلول ها اضافه کرده و پس از سانتریفیوژ با دور 1000-1500 rpm مایع رویی را دور می ریزیم. در این مرحله از سلول های تک هسته ای جدا شده، سلول های C-Kit+ با استفاده از روش MACS جدا خواهند شد . جدا سازی سلول های C-Kit+ و C-Kit- با استفاده از روش MACS (Magnetic Activated Cell Sorting): اساس این روش استفاده از آنتی بادی های علیه شاخص C-Kit می باشد. این آنتی بادی ها در قسمت FC (Fragment Crystalization) حاوی قطعات الکترومغناطیسی مثل آهن و نیکل می باشند. پس از اتصال آنتی بادی ها به سلول های مورد نظر، آن ها را از یک ستونی (LS column) رد می کنند که در دیواره آن خاصیت آهنربایی وجود دارد. سلول های C-Kit+ همراه با آنتی بادی ها جذب دیواره های ستون شده و سلول های C-Kit - عبور می کنند. به این ترتیب سلول های C-Kit+ و- C-Kit از هم جدا می شوند.سپس از هرکدام از این سلول ها با استفاده از لام نئوبار1میلیون سلول جدا می نماییم. تعیین هویت سلول های C-Kit+ و - C-Kit با استفاده از روش FACS(Flourecence- Activated Cell Sorting): پس از جدا سازی تعیین هویت سلول های C-Kit+ با استفاده از روش FACS انجام می شود. این کار با روش فلوسایتومتری و با استفاده از آنتی بادی های حاوی فلورسنت ضد C-Kit+ صورت می گیرد. به این صورت که آنتی بادی مذکور را به سلول های C-Kit+ اضافه کرده و به مدت 40-20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه می کنیم. سپس با استفاده از دستگاه Facscalibur و نرم افزار Flowjo درصد سلول های C-Kit+ را میسنجیم. در حالت نرمال درصد این سلول ها باید بالای 85% باشد. تزریق سلول های C-Kit+ استخراج شده: بعد از بیهوش کردن حیوانات با کتامین mg/kg 80 و زایلازین mg/kg 10، تزریق طبق گروه بندی انجام شده بصورت داخل وریدی بعد از محرز شدن دیابت، انجام خواهد شد. در این مدت قند خون بطور منظم اندازه گیری خواهد شد. دو ماه پس از تزریق C-KitT حیوانات با تزریق داخل صفاقی کتامین mg/kg 80 و زایلازین mg/kg 10، بیهوش شده و بلافاصله کلیه چپ برای تغییرات بافت شناسی خارج و در فرمالین 10%تثبیت خواهد شد. همچنین کلیه راست خارج شده و برای اندازه گیری PI3K، Akt،GSK 3β و بیان Bax ، Caspase‑3 و Bcl2 ,توسط ازت مایع منجمد و تا زمان اندازه گیری در دمای منهای 70 نگهداری خواهد شد. در پایان نمونه برداری، حیوانات با تزریق دوز بالای کتامین(300mg/kg) و زایلازین(30mg/kg) کشته و لاشه تمامی حیوانات در داخل کیسه زباله در بسته قرار گرفته و به مسئول حیوانخانه تحویل خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 68029 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی تاثیر تزریق وریدی c-kit+ بر روند آپوپتوز در بافت کلیه از طریق مسیر سیگنالینگ PI3K/Akt/GSK 3β و بیان Bax ، Caspase‑3 و Bcl2 در رتهای نر دیابتیک نوع 2 |
| عنوان لاتین طرح | The effect of intravenous c-kit + injection on the process of apoptosis in renal tissue via PI3K / Akt / GSK 3β signaling pathway and Bax, Caspase ‑ 3 and Bcl2 expression in type 2 diabetic male rats |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | پیشگیری و اپیدمیولوژی و مراقبت در بیماریهای شایع متابولیک و غدد ( دیابت، چاقی و کبد چرب) |
| نوع مطالعه | طرح تحقیقاتی-پژوهشی |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | دکتری عمومی |
| مدت اجرا - ماه | 12 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | در سالهای اخیر با توجه به شیوع زیاد دیابت و بروز عوارض ناشی از آن که موجب افزایش هزینه های دارو و درمان و فشار اقتصادی برای بیماران و سیستم بهداشت ودرمان شده است ، ارایه راهکارهای درمانی برای کنترل این بیماری با حداقل دارو، زمان و هزینه، منطقی به نظر میرسد. در این میان استفاده از روشهای درمانی با تاثیر طویل المدت مورد توجه محققان قرار گرفته است. یکی از این روشها کاربرد سلولهای بنیادی می باشد. |
| اهداف اختصاصی | تعیین اثر سلولهای ⁺ c-kit استخراج شده از مغز استخوان برتغییرات بافتی در کلیه رت های دیابتی نوع دو -تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر PI3K بافت کلیه رت های دیابتی نوع دو -تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر AKT بافت کلیه رت های دیابتی نوع دو -تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر GSK-3β بافت کلیه رت های دیابتی نوع دو -تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر BAX بافت کلیه رت های دیابتی نوع دو -تعیین اثر سلولهای c-kit ⁺ استخراج شده از مغز استخوان بر Bcl2 بافت کلیه رت های دیابتی نوع دو -هدف 7-تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر Caspase 3 بافت کلیه رت های دیابتی نوع دو هدف 8-تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر IL6 بافت کلیه رت های دیابتی نوع دو هدف 9-تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر TNF-α بافت کلیه رت های دیابتی نوع دو |
| چکیده انگلیسی طرح | In this study, 58 Wistar male rats in the weight range of 180-220 g will be studied according to the following groups (12 rats in each group): The 10 animals were randomly selected to extract c-kit⁺ and c-kitˉ stem cells and the remaining animals were randomly divided into the following groups; 1.Control group (C group): receiving 50 µl of normal saline solution intravenously. 2. Diabetic group (D group): diabetic animals receiving 50 µl of normal saline solution intravenously. 3. Diabetic c-kit⁺ cell group (D c-kit⁺ group): diabetic animals receiving 50 µl of normal saline solution containing 300000 c-kit⁺ cells intravenously. 4. Diabetic c-kitˉ cell group (D c-kit¯ group): diabetic animals receiving 50 µl of normal saline solution containing 300000 c-kit¯ cells intravenously. How to induce diabetes: For induction of human-like type 2 diabetes, animals in the diabetic groups will feed with a high-fat diet contained certain percentages of substances including: Wheat flour 10%, sucrose 20%, sheep fat 31%, casein 25%, vitamin and mineral blend 6%, methionine 0.3%, bread's yeast 0.1% and sodium chloride 0.1%. After one month, streptozotocin (35mg/kg) will be injected intraperitoneally. To diagnose and confirm diabetes, a small lesion was injected into the animal's tail by a lancet, a blood drop was placed on a glucometer tape and then read through a glucometer (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN) and blood glucose above 250 mg/dl. It is considered an indicator of diabetes. Glucose tolerance tests will be performed to confirm type 2 diabetes. Extraction of C-kit + and C-Kit- Stem Cells from Rat Bone Marrow Isolation of C-Kit + and C-Kit- Cells Using MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) Identification of C-Kit + and - C-Kit Cells Using FACS (Flourecence- Activated Cell Sorting) Injection of extracted C-Kit + cells. This is done by flow cytometry using antibodies containing anti-C-Kit + fluorescent. We add the antibody to the C-Kit + cells and incubate for 20-40 minutes at 4 ° C. Then, with Facscalibur device and Flowjo software, we measure the percentage of C-Kit + cells. Normally the percentage of these cells should be above 85%. Injection of extracted C-Kit + cells: After anesthetizing the animals with 80 mg / kg ketamine and 10 mg / kg xylazine, the injection will be done intravenously according to the grouping after diabetes is diagnosed. During this time, blood sugar will be measured regularly. Two months after C-KitT injection, the animals were anesthetized by intraperitoneal injection of 80 mg / kg ketamine and 10 mg / kg xylazine, and immediately the left kidney was removed for histological changes and fixed in 10% formalin. Also, the right kidney is removed to measure PI3K، Akt،GSK 3β and the expression of Bax ، Caspase‑3 و Bcl2 , by freezing liquid nitrogen until minus 70 ° C. At the end of the sampling, the animals are killed by injecting high doses of ketamine (300 mg / kg) and xylazine (30 mg / kg) and the carcasses of all animals are placed in a sealed garbage bag and delivered to the animal warden. |
| کلمات کلیدی | سلولهای ⁺c-kit⁺: c-kit پروتئینی است که در سطح بسیاری از انواع مختلف سلول وجود دارد که به فاکتور سلول های بنیادی (SCF) متصل می شود و باعث رشد برخی سلول های خونی می شود. C-kit نوعی از گیرنده تیروزین کینازی است. همچنین به آن CD117 و گیرنده فاکتور سلولهای بنیادی گفته می شود. سلول های دارنده ی این گیرنده، c-kit+ نامیده میشوند. دیابت نوع 2: نوعی اختلال در سوخت و ساز بدن است که با بالا بودن گلوکز خون در شرایط مقاومت در مقابل انسولین و کمبود نسبی انسولین شناسایی میشود. AKT: Akt (protein kinase B) در تنظیم برخی از فعالیتهای سلول از جمله متابولیسم گلوکز، سنتز گلیکوژن، سنتز پروتئین، تکثیر سلولی، هایپرتروفی سلول و مرگ سلول شرکت میکند. PI3K/AKT: این مسیر در تمایز ، پرولیفراسیون ، آپوپتوز و مهاجرت سلولی نقش دارد و افزایش فعالیت آن میتواند منجر به اختلال عملکرد سلول شود. GSK-3β: GSK-3 یا گلیکوژن سنتتاز کیناز 3 یک آنزیم محدود کننده برای مهار سنتز گلیکوژن می باشد و در تنظیم سیگنالهای گوناگونی ازجمله سیگنالینگ سلولی انسولین نقش دارد Bax : از جمله واسطههای پروآپوپتوتیک می باشد. Bcl-2: از جمله واسطههای آنتی آپوپتوتیک می باشد. کاسپاز3: آپوپتوز از دو طریق داخل و خارجی سبب فعال شدن گروهی از پروتئازهای وابسته به آسپارتات به نام کاسپازها به خصوص Caspase‑3 میشود. آپوپتوز: گونهای از مرگ سلولی یا زوال سلولی طی فرایند مرگ برنامهریزیشده سلول است که در جانداران پرسلولی به وقوع میپیوندد. آپوپتوز روندی فیزیولوژیک و زیستی برای نمو فعّال و طبیعی و همچنین حفظ هموستازی میباشد ولی می تواند از طریق مسیرهای مختلفی، بصورت غیر طبیعی برانگیخته شود. اپوپتوز در اثر فعال شدن آنزیمهای گروه کاسپاز رخ میدهد. نسبت درون سلولی پروتئینهای مشوق اپوپتوز مانند (BAX) به پروتئینهای ضد اپوپتوز مانند(BCL_2) تعیینکننده حساسیت سلول نسبت به آپوپتوز میباشد. |
| ذینفعان نتایج طرح |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| فریبا میرزائی باویل | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| رعنا کیهان منش | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| فریبا قیاسی | مشاور |
| الناز سلمانی کرجان | همکار اصلی |
| فاطمه عابدینی | همکار اصلی |
| نوید نظر پور اجیرلو | دانشجوی مالک پایان نامه |
| لیلا روشنگر | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر تزریق سلولهای بنیادی میتواند از طریق تعدیل فاکتورهای دخیل در بروز نفروپاتی دیابتی، شدت عوارض کلیوی دیابت را در موش کاهش دهد.متن خبر نفروپاتی به عنوان یک عارضه مهم در دیابت گزارش شده است که منجر به افزایش مرگ و میر در بیماران دیابتی می شود. مطالعات نشان داده اند که در بیماران مبتلا به دیابت نوع دو، استفاده از پتانسیل سلولهای بنیادی میتواند سبب کاهش نفروپاتی دیابتی گردد. با توجه به اهمیت مسیر مسیر سیگنالینگ PI3K/Akt/GSK 3β و بیان Bax ، Caspase 3 و Bcl2 در بروز و پیشرفت نفروپاتی دیابتی، در این مطالعه تأثیر تزریق سلولهای C-Kit بر بیان این فاکتورها در بافت کلیه موشهای صحرایی دیابتی نوع دو مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته های این مطالعه نشان داد که تزریق سلولهای بنیادی باعث تعدیل این فاکتورها در شرایط دیابتی و معکوس شدن آنها در بافت کلیه می شود. توصیه ما برای کاربران این نتایج، استفاده از سلولهای بنیادی در درمان و پیشگیری از عوارض دیابت مخصوصا نفروپاتی و کاهش بار این بیماری میباشد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
