تولید و تخلیص پروتئین A نوترکیب استافیلوکوکی
Production and purification of recombinant staphylococcal protein A
مجریان: مصطفی اکبرزاده خیاوی
خلاصه روش اجرا: در ابتدا پرایمر اختصاصی ژن SPA کد کننده پروتئین A کامل با توجه به توالی ژنوم کامل باکتری استافیلوکوکوس اورئوس موجود در NCBI/Genebank طراحی و برای ساخت به شرکت سیناکلون (تهران-ایران) سفارش داده می شود. ژن کدکننده پروتئین A با استفاده از تکنیک PCR شناسایی و تکثیر می گردد. توالی ژنی پروتئین A استافیلوکوکی در بین سویه های مختلف معمولا دارای درصد بالای مشابهت و حدود 90 درصد توالی های حفاظت شده هستند که در طراحی پرایمر می تواند مورد استفاده قرار گیرد. ژن SPA با استفاده از تکنینک Cloning داخل یک وکتور بیانی مهندسی شده از خانواده pET دارای ژن مقاومت آمپی سیلین کلون شده و ابتدا در یک سوش غیر بیانی (Ecoli strain DH5α) و سپس داخل یک سوش بیانی E. coli (Origami) کلون می شود. به منظور انجام این تکنیک، محصول PCR با آنزیم های محدودالاثر (NdeI , XhoI) برش داده شده و در وکتور خطی شده وارد می گردد. علاوه بر این، دنباله هیستیدین (His-tag) به دو انتهای C و N توالی به منظور تسهیل خالص سازی و شناسایی پروتئین اضافه می شود. نتایج کلونینگ بوسیله تکنیک PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن SPA و پرایمرهای عمومی وکتور pET مورد بررسی قرار می گیرد. تایید نهایی کلونینگ با استفاده از تعیین توالی ژن هدف انجام می شود. پس از تایید صحت انجام Cloning، کلونی های مثبت حاوی وکتور-ژن SPA برداشته شده و 12 ساعت در دمای 37 در محیط LB انتخابی حاوی آنتی بیوتیک انکوبه می شوند. کشت 12 ساعته با رقت 1 به 50 به محیط تازه LB حاوی آنتی بیوتیک تلقیح می شود. زمانیکه OD600 باکتری در محیط تقریباً 7/0-6/0 شود القای تولید پروتئین با استفاده از IPTG و کاهش دما به 20 درجه سانتیگراد انجام می شود. پس از انکوباسیون به مدت زمان مناسب، تمامی پروتئین داخل سلولی استخراج شده و با روش های ایمنوبلاتینگ (Western blot, SDS-PAGE) مورد بررسی و ارزیابی قرار می گیرند. علاوه بر این برای تولید آزمایشگاهی پروتئین نوترکیب A از کشت غیر مداوم در فرمانتور 5 لیتری همزن دار با حجم کاری دو لیتر محیط کشت استفاده خواهد شد. در ادامه خالص سازی پروتئین هدف با استفاده از روش های کروماتوگرافی تمایلی و رزین نیکل سفاروز انجام می شود. برای تعیین خلوص نهایی پروتئین نوترکیب تولیدی از تکنیک FPLC) Fast protein liquid chromatography ) استفاده خواهد شد. خصوصیات اتصال و میزان تمایل پروتئین A تولید شده به ایمونوگلوبولین های انسانی با استفاده از تکنیک الایزا مورد بررسی قرار خواهد گرفت.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا در دانشکده/مرکز |
| کد طرح | 66616 |
| عنوان فارسی طرح | تولید و تخلیص پروتئین A نوترکیب استافیلوکوکی |
| عنوان لاتین طرح | Production and purification of recombinant staphylococcal protein A |
| نوع طرح | طرح فناورانه |
| اولویت طرح | ساخت و ارتقاء کیفیـت و تجاری سازی مواد، تجهیزات پزشکی و تستهای آزمایشگاهی |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | خير |
| مقطع پایان نامه | |
| مدت اجرا - ماه | 18 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | 1- شناسایی ژن کدکننده پروتئین A از سویه استافیلوکوکوس اورئوس بومی، کلونینگ آن در وکتور بیانی مناسب جهت تولید پروتئین A بصورت نوترکیب در سیستم بیانی پروکاریوتی E. coli 2- بهینه سازی فرآیند تولید در فرمانتور آزمایشگاهی به روش تخمیر غوطه ور بمنظور افزایش راندمان تولید پروتئین A 3- کروماتوگرافی تمایلی با استفاده از رزین های جامد غیرفعال حاوی این پروتئین (Mabselect resi) که از رایج ترین روش های خالص سازی آنتی بادی های مونوکلونال پرکاربرد در صنعت بیوتکنولوژی و داروسازی به شمار می رود و بومی سازی تولید آن برای کشور ضروری به نظر می رسد. |
| اهداف اختصاصی | تولید و تخلیص پروتئین A نوترکیب استافیلوکوکی |
| چکیده انگلیسی طرح | Protein A is widely used in antibody purification, rapid pathogen detection, and immunological assays, in large part due to its high affinity for human immunoglobulins and various classes of animal immunoglobulin G. Affinity chromatography using solid resins containing protein A is one of the most common methods for purification of monoclonal antibodies. This method has been widely used in the biotechnology and pharmaceutical industries. The aim of this study is to identify the protein A coding gene of native Staphylococcus aureus, cloning in a suitable expression vector for the production of recombinant protein A in the prokaryotic expression system. In addition, an optimization process will be conducted to increase the production rate and purification efficiency. |
| کلمات کلیدی | پروتئین A: پروتئین A یکی از پروتئین های سطحی دیواره سلولی باکتریایی است که بطور عمده در سویه های مختلفی از استافیلوکوکوس ها بخصوص استافیلوکوک اورئوس گزارش شده است. - استافیلوکوکوس اورئوس: استافیلوکوک اورئوس، کوکسی گرم مثبت و بیهوازی اختیاری است که مهمترین گونه در جنس استافیلوکوک از نظر پزشکی محسوب میشود. - میزبان پروکاریوتی: میزبان های باکتریایی هستند که در آنها مواد هسته ای در غشا قرار ندارند و هسته مشخصی را تشکیل نمیدهند. - پروتئین نوترکیب: پروتئینی است که توسط DNA نوترکیب رمزگذاری می شود و در سیستمی شبیه سازی می شود که بیان ژن و ترجمه از روی mRNA را پشتیبانی می کند. کلونینگ: فرآیندی است که طی آن توالی مشخصی از DNA را جداسازی میکنند تا نسخههای یکسانی از آن را در محیط طبیعی ( سلول یا بافت زنده ) بدست آورند. بیان: منظور از بیان، ترجمه ژن کلون شده آنزیم به یک پروتئین عملکردی بصورت نوترکیب در سلول میزبان می باشد. فرمانتور: فرمانتور دستگاهی است که شرایط بهینه را برای رشد میکرو ارگانیسمها مثل قارچ و باکتری و مخمر فراهم میکند. میکرو ارگانیسمها در این شرایط خاص، بهتر و بیشتر رشد وفعالیت خواهند کرد. تخمیر غوطه ور: شامل کشت میکروارگانیسم ها در یک محیط مایع است که بیش از 95٪ آب دارد. |
| ذینفعان نتایج طرح | شرکتهای داروسازی و بیوتکنولوژی |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| مصطفی اکبرزاده خیاوی | مجری اول (اصلی-هیات علمی) |
| اعظم صفری | همکار اصلی |
| محمد حسین صومی | همکار اصلی |
| علیرضا خبازی اسکویی | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر تولید پروتئین دست ورزی شده A در جهت تخلیص آنتی بادی ها و ایمنوگلوبولینها از میکروارگانیسم بومیمتن خبر پروتئین A یکی از پروتئین های سطحی دیواره سلولی باکتریایی است که به دلیل تمایل بالای اتصال به ایمونوگلوبولین های انسانی به طور گسترده ای در فرایندهای خالص سازی، تشخیص آنتی بادی، تشخیص سریع پاتوژن ها و آنالیزهای ایمونولوژیک مورد استفاده قرار می گیرد. در این طرح، به کمک دانش زیست فناوری و مهندسی ژنتیک، پروتئین A از سویه استافیلوکوکوس اورئوس بومی، بصورت نوترکیب در سیستم بیانی پروکاریوتی تولید شد. |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر تولید پروتئین نوترکیب A استافیلوکوکی در جهت تخلیص آنتی بادی ها و ایمنوگلوبولینهامتن خبر پروتئین A یکی از پروتئین های سطحی دیواره سلولی باکتریایی است که به دلیل تمایل بالای اتصال به ایمونوگلوبولین های انسانی به طور گسترده ای در فرایندهای خالص سازی، تشخیص آنتی بادی، تشخیص سریع پاتوژن ها و آنالیزهای ایمونولوژیک مورد استفاده قرار می گیرد. در این طرح، کلونینگ ژن کدکننده پروتئین A از سویه استافیلوکوکوس اورئوس بومی، در وکتور بیانی مناسب جهت تولید پروتئین A بصورت نوترکیب در سیستم بیانی پروکاریوتی در فرمانتور آزمایشگاهی به روش تخمیر غوطه ورانجام یافت. این پروتئین نوترکیب تولیدی قابلیت تخلیص آنتی بادی ها از پلاسما را به خوبی نشان داده است لذا کارایی و قابلیت مناسبی برای جایگزینی نمونه مشابه و ستوهای تخلیصی برای استفاده در تخلیص آنتی بادی های مونوکلونال از سورس های مختلف را خواهد داشت. در حال حاضر توانایی تخلیص آن به ازای هر 10 میلی گرم پروتئین A ایموبلایز شده روی ستون تخلیص، حدود 30 میلی گرم IgG از یک سی سی پلاسما می باشد که راندمان تخلیصی قابل توجهی را نشان می دهد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
