بررسی تاثیر نانوذرات بارگیری شده با SiRNA ضد Nrf2 و سیکلوفسفامید بر روی سلولهای لوسمی لنفوئیدی مزمن (CLL)
Investigating the effect of nanoparticles loaded with SiRNA molecules against Nrf2 And cyclophosphamide on chronic lymphoid leukemia (CLL) cells.
مجریان: فرهاد جدیدی نیارق
خلاصه روش اجرا: از هر فرد بیمار CLL و افراد نرمال به میزان 25 میلیلیتر خون وریدی گرفته شده و در لوله های حاوی هپارین ریخته می شود. سپس نمونه ها با محیط کشت سلولی RPMI-1640 رقیق شده و توسط فایکول، PBMCها جدا می شوند. مطالعه بر روی نمونه های خون محیطی( PBMC) ۱۰ بیمار باCLL تایید شده انجام خواهد شد. همچنین اطلاعات بیشتری از برخی ویژگی های بیماران مثل ناهنجاریهای ژنتیکی راجعه ، رویکردهای درمانی قبل از عود و بازگشت بیماری مربوط به بیمارانand remission relapse ، جنسیت بیماران و نمونه خون محیطی نیز برای ارزیابی های تکمیلی جمع آوری خواهد شد . نمونههای خون محیطی همچنین از اهدا کنندگان سالم به صورت موازی و منطبق به عنوان گروه کنترل دریافت خواهد شد. در این مطالعه داروهای شیمی درمانی سرطان رایج، SiRNA ، سیکلوفسفامید به همراه آنتی بادی ضد CD20و نانو ذرات حامل به صورت SINGLE AGENT و COMBINATIONAL استفاده خواهد شد. این مطالعه دو فاز دارد: ۱.تولید و بررسی ویژگی های فزیکوشیمیایی نانو ذرات کیتوزان لاکتات کونژوگه شده با آنتی بادی ضد CD20 حاوی siRNA ضد Nrf2 و سیکلوفسفامید ابتدا به منظور اتصال آنتیبادیهای ضدCD20 به سطح کیتوزان، آنها را با نانوذره کیتوزان مجاور میکنیم و با نسبت مولی(1.1) با بافر سدیم استات(PH=5.5) اضافه کرده وEDC (0.5mM) به همراه Sulfo-NHS(0.25mM) بهعنوان عوامل فعالکننده به مخلوط اضافهشده و بهصورت تام شب ( overnight) در دمای 4درجه سانتی گراد روی استریر قرار میدهیم. و بهمنظور جلوگیری از دناتوره شدن Ab با کیسه دیالیز MWCO14000 به مدت3 روز مورد دیالیز قرار میدهیم ،کونژوگه آنتیبادی و کیتوزان توسط الکتروفروز در ژل 4% تائید میشود و سپس مخلوط کیتوزان و آنتی بادی ضدCD20 را با اسیدلاکتیک مجاور میکنیم ترکیب کیتوزان لاکتات حاوی آنتی بادی ضدCD20 را تولید میکنیم. سپس باید نانوذرات کیتوزان لاکتات siRNA مداخلهگر و سیکلوفسفامید را در بربگیرند. و نانوذرات حاوی siRNA تولید میشوند که خصوصیات فیزیکو شیمیایی آنها بررسی میشود. تولید کمپلکس نانوذرات حاوی آنتی بادی ضدCD20-siRNA با ژل اکتروفورز در ژل 2% آگارز تائید میشود و میزان بارگیری siRNA و سیکلوفسفامید بهصورت کمی به وسیله روش اولتراسانتریفیوژ بررسی خواهد شد. همچنین ویژگی های فیزیکوشیمیایی نانوذرات با استفاده از میکروسکوپ الکترونی SEM (برای بررسی مورفولوژی نانوذرات)، DLS Zeta sizer (برای بررسی اندازه و پتانسیل زتا)، و ژل الکتروفورز (به منظور بررسی پایداری سرمی) بررسی خواهد شد. ۲. مطالعه ex vivo اثربخشی نانو ذرات تهیهشده : به منظور جداسازی PBMC، 25 میلی لیتر خون وریدی در لوله ی حاوی ماده ضد انعقاد هپارین از افراد مبتلا به لوسمی لنفوئیدی مزمن گرفته شده و با نسبت 1:1 با RPMI-1640 رقیق می شود و در نهایت این خون رقیق شده با احتیاط بر روی 25 میلی لیتر فایکول به آرامی اضافه می شود تا خون و فایکول با هم ادغام نشوند. سپس این لوله ها داخل سانتریفیوژ در دور g ×400 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ می شوند. پس از سانتریفیوژ حلقه سفید رنگ حاوی سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) جداسازی می شود. این سلولها در محیط RPMI1640 حاوی fetal bovine serum 10% و آنتیبیوتیک کشت داده میشوند. پس از گذشت ۲۴ ساعت از کشت سلولی نانوذرات حاوی siRNA و سیکلوفسفامید را به محیط کشت PBMC بیمار و نرمال اضافه میکنیم. برای ارزیابی تکثیر سلولی، سلولها تحت داروهای مورد آزمایش تیمار میشوند و سپس بقای سلولها توسط MTT تعیین میشود، اثرات افزایشی سینرژیستی و آنتاگونیستی داروها نسبت به هم توسط COMPUSYN SOFTWARE تعیین میشود .تیمارهای دارویی در ۳ تکرار انجام میشود تا آزمایش بهصورت مستقل و غیر وابسته انجامشده باشد. آنالیز فلوسیتومتری اپوپتوز با استفاده از PROPIDUM IODIDE (PI) /ANNEXIN V بر اساس دستورالعمل سازنده انجام خواهد شد و درصد سلولهای ANNEXIN V /PI POSITIVE با ارزیابی حداقل ۱۰۰۰۰ سلول تعیین خواهد شد ،میانگین درصد سلولهای ANNEXIN V /PI POSITIVE و خطای استاندارد حداقل در دو آزمایش مستقل محاسبه خواهد شد. همچنین تاثیر درمان ترکیبی بر روی بیان ژن های درگیر در آپوپتوز نظیر BCL2 و BAX در سطح mRNA و پروتئین به ترتیب با تست های Real-time PCR و وسترن بلات بررسی خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 66163 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی تاثیر نانوذرات بارگیری شده با SiRNA ضد Nrf2 و سیکلوفسفامید بر روی سلولهای لوسمی لنفوئیدی مزمن (CLL) |
| عنوان لاتین طرح | Investigating the effect of nanoparticles loaded with SiRNA molecules against Nrf2 And cyclophosphamide on chronic lymphoid leukemia (CLL) cells. |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | نانوفیبرها، نانوذرات و اسکافولدها (در طب بازساختی، مهندسی بافت و دارورسانی) |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | کارشناسی ارشد |
| مدت اجرا - ماه | 14 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | در این مطالعه ما برای اولین بار از یک نانوسامانه هوشمند هدفمند با استفاده از آنتی بادی ضد CD20 بصورت کاملا اختصاصی قصد داریم سلول های لوسمیک را هدف قرار داده و با تحویل siRNA-Nrf2 و سیکلوفسفامید موجب القای مرگ سلولی در سلول های بدخیم شویم. سرطان خون یا لوکمیا (Leukemia یا Leukaemia) گروهی از انواع سرطان است که معمولاً از مغز استخوان شروع میشود و باعث شکلگیری تعداد زیادی از لکوسیت های غیرطبیعی میگردد. ازجمله این لوسمی ها میتوان به لوسمی لنفوسیتی مزمن (CLL) اشاره کرد. CLL یا بدخیمی لنفوسیتهای CD5+ از شایعترین لوسمی ها در بزرگسالان محسوب میشوند تشخیص آزمایشگاهی این بیماری شامل شمارش سلولهای خونی، اسمیر خونی و ایمونوفنوتایپینگ سلولهای لنفوئیدی است.سیر بالینی CLL یکنواخت نیست، برخی از بیماران بلافاصله پس از تشخیص نیاز به درمان دارند و برخی دیگر تا سالیان زیاد پس از تشخیص نیازی به درمان ندارند. بیشتر بیمارانی که در مراحل پیشرفته بیماری (Binet یا Rai) بوده و نیاز به درمان فوری دارند. چندین فاکتور شامل موتاسیون در Immunoglobulin variable region heavy chain (IGVH) ،تغییرات ژنتیکی، سن بیمار و وجود اختلالات دیگر در تعیین استراتژی نوع درمان ارزشمند است درمانهای موجود شامل شیمیدرمانی، ترکیب شیمیدرمانی و ایمونوتراپی سایر روشهای درمانی که مسیرهای سیگنالینگ لنفوسیتهای B و مسیرهای آپوپتوزیس را مورد هدف قرار میدهند . با توجه به ناهمگونی و پیچیدگی سلولهای CLL ، کشف بیومارکرهای جدید برای افزایش دقت تشخیص و به دست آوردن بینش جامع در مورد درمان مؤثرتر ضروری است. اگرچه پیشرفتهای بسیاری در زمینه شناخت عوامل بیماریزایی CLL انجامشده و همچنین نتایج درمانی نیز بهبود قابلتوجهی داشته است، بااینوجود درصدی از بیماران پاسخ به درمان نامطلوبی دارند وبه مرور به داروهای استفادهشده مقاوم میشوند. به همین دلیل نیاز بالینی برای تشخیص اهداف درمانی جدید برای یافتن درمانهای با کارایی بالا و افزایش نرخ بقا در بیماران CLL احساس میشود. همچنین مطالعات قبلی نشاندهنده ثمربخش بودن کارایی درمانهای ترکیبی جدید در همراهی با داروهای مبتنی بر نانو داروهای هوشمند ، اینگونه اثرات همیاری داروها در کاهش دوز های درمانی و القا مجدد آپوپتوزیس در سلولهای CLL مقاوم به پروسه آپوپتوز بهتبع آن کاهش سمیت ناشی از رویکردهای درمانی رایج نیز مؤثر میباشد. |
| اهداف اختصاصی | تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات کونژوگه با آنتی بادی CD20 حاوی siRNA ضد Nrf2 و سیکلوفسفامید -مطالعه ex vivo اثربخشی نانو ذرات تهیه‌شده: |
| چکیده انگلیسی طرح | Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is typically a population of small, round, mature B lymphocytes in the blood, bone marrow, and lymph nodes that have CD19, CD5, CD23, ROR1, Zap70, and CD38 expression and poor expression of CD20, CD79b, and immunoglobulin. Flow cytometry and immunophenotyping are used to confirm the presence of this cancer. Although many advances have been made in identifying the pathogens of CLL and the treatment outcomes have improved significantly, a percentage of patients respond poorly to treatment and eventually become resistant to the drugs used.Rituximab(anti-CD20 antibody) is a drug routinely used to treat chronic lymphoid leukemia AND Nuclear factor Erythroid-dependent factor 2 (NRF2), also known as erythrocyte-derived nuclear factor 2, is a transcription factor that is encoded in humans by the NFE2L2 gene. NRF2 is an essential zipper leucine protein (bZIP) that regulates the expression of antioxidant proteins that protect against oxidative damage caused by injury and inflammation. NRF2 is at the center of a complex regulatory network and plays a vital pleiotropic role in regulating metabolism, inflammation, autophagy, proteostasis, mitochondrial physiology, and immune responses. Several drugs that stimulate the NFE2L2 pathway are being studied for the treatment of oxidative stress-induced diseases, which in chronic lymphocytic leukemia increase NRF2 expression, leading to resistance to invasive cell apoptosis,SO NRF2 inhibitor SiRNA induces apoptosis and reduces the drug resistance process. . In this study, for the first time, we intend to target leukemic cells from a targeted smart nanodrug using anti-CD20 antibody(Rituximab) in a completely specific manner and induce cell death in malignant cells by delivering siRNA-Nrf2 and cyclophosphamide. |
| کلمات کلیدی | Nrf2: یک فاکتور رونویسی است که همچین بهعنوان nuclear factor erythroid-derived 2-like 2 شناختهشده و در انسان توسط ژن NFE2L2 رمزگذاری میشود. NRF2 یک پروتئین اساسی زیپ لوسین (bZIP) است که تنظیم پروتئینهای آنتیاکسیدانی را که از آسیب اکسیداتیو ناشی از آسیب و التهاب محافظت میکند ، تنظیم میکند. SiRNA : (RNAi) مداخلهگر اصطلاحی است که به مکانیسم خاموشی پس از رونویسی توسط RNA دو رشتهای گفته میشود. در تکنولوژی RNA های مداخلهگر (siRNA) ، رشته مکمل mRNA ژن موردنظر ساختهشده و این رشته به mRNA ژن هدف متصل و یک توالی دو رشتهای (dsRNA) را به وجود میآورد. ازآنجاکه سیستم سنتز پروتئین قادر به ترجمه mRNA دو رشتهای نیست، و بنابراین بیان ژن هدف متوقف و اصطلاحاً ژن خاموش میشود. سیکلوفسفامید(Cyclophosphamide): سیکلوفسفامید یک داروی ضد سرطان است که در بدن به یک متابولیت فعال آلکیله کننده تبدیل میگردد بهراحتی از دستگاه گوارش جذب میگردد و از سد خونی مغزی عبور کرده و بهطور گسترده در بافتها و مایعات بدن توزیع میگردد و در کبد به متابولیتهای فعال تبدیل شده و مکانیسم اثر این دارو به طور عمده ناشی از ایجاد اتصال بین دو رشته مولکولی DNA و شکستن DNA و RNA و نیز مهار سنتز پروتیین است. keap-1: مهار کننده فاکتور رونویسی Nrf2 است که Keap1 با Nrf2 در سیتوپلاسم کمپلکس تشکیل داده مانع انتقال Nrf2 به هسته می شود ،در واقع یک تنظیمکننده اصلی پاسخ آنتیاکسیدانی است ، که برای بهبود استرس اکسیداتیو مهم است. ریتوکسیمَب(Rituximab): بانام تجاری «ریتوکسان» و «مَـبترا» و «زیتاکس» دارویی است که جهت درمان برخی انواع بیماریهای خودایمنی و سرطانها بکار میرود. این دارو یک آنتی بادی کایمریک علیه پروتئین CD20 است که عموماً بر روی سطحِ لنفوسیتهای B یافت میشود. ریتوکسیمب بااتصال به «CD20»، موجب مرگ سلولی میشود. Bach1: پروتئین تنظیمکننده رونویسی است که در انسان توسط ژن BACH1 رمزگذاری میشود در قالب repressor رونویسی به مناطق Enhancer متصل شده مانع اتصال Nrf2 میشود. هم اکسیژناز -1 (HO-1):یکی از پروتئینهای بسیار مهم که اثرات مضر رادیکالهای آزاد را کاهش میدهد مولکول هم اکسیژناز (HO-1) است که در بسیاری از عملکردهای سلولی دخالت دارند و مهمترین ویژگیشان نقش آنها چرخه تجزیه یا کاتابولیسم هم است که در بدن به دلایل زیادی مهم است میتواند هم اثرات آنتیاکسیدانی و هم ضدالتهابی داشته باشد ، زیرا با استفاده از بیلیوربین ردوکتاز میتوان بیلیوردین به آنتیاکسیدان بیلیروبین کاهش داد و مونوکسید کربن میتواند اثرات ضدالتهابی و آپوپتوز داشته باشد. ADCC: مکانیسم دفاع ایمنی باواسطه سلول است که بهموجب آنیک سلول مؤثر از سیستم ایمنی بدن بهطور فعال یک سلول هدف ، که آنتیژنهای سطح غشایی آن توسط آنتی بادیهای خاص پوشیده شده است ، لیز میکند. اینیکی از مکانیسمهایی است که از طریق آن آنتی بادیها بهعنوان بخشی از پاسخ ایمنی هومورال میتوانند برای محدود کردن و مهار عفونت عمل کنند. CDC: عمدتاً عملکردی از آنتی بادیهای IgG و IgM است. هنگامیکه آنها به آنتیژن سطح سلول هدف (مانند سلول باکتری یا ویروس آلودهشده به ویروس) متصل شوند ، مسیر اتصال کلاسیک کمپلمان بااتصال پروتئین C1q به این آنتی بادیها آغاز میشود ، و درنتیجه تشکیل یک کمپلکس حمله غشایی (MAC) و لیز سلول هدف ایجاد میشود. |
| ذینفعان نتایج طرح | بیماران سرطانی و محققان |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| فرهاد جدیدی نیارق | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| عباسعلی حسین پورفیضی | مشاور |
| بهزاد برادران | مشاور |
| عاطفه خداکرمی | دانشجوی مالک پایان نامه |
| فرناز حاجی زاده | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر مهار Nrf2 موجب حساسیت سلول های لوسمیک به سیکلوفسفامید می شود.متن خبر یکی از معضلاتی که امروزه در درمان لوسمی ها با روش های سنتی سابق مثل کموتراپی و رادیو تراپی وجود دارد مقاومت به درمان و عود مکرر لوسمی ها می باشد. بر این اساس معرفی و شناسایی اهداف جدید درمانی برای افزایش بقا افراد مبتلا به لوسمی از جمله لوسمی لنفوبلاستیک مزمن حائز اهمیت است. در لوسمی لنفوبلاستیک مزمن افزایش بیان فاکتور القا کننده رونویسی Nrf2 رخ می دهد که باعث رشد سلولی و پاسخ های ضد آپوپتوزی می شود. بنابراین سرکوب Nrf2 به عنوان هدف جدید، می تواند موجب کاهش مقاومت به سیکلوفسفامید شود. در این مطالعه برای اولین بار از نانوذرات کیتوزان به عنوان سیستم انتقالی سیکلوفسفامید و siRNA برای مهار Nrf2 در سلول های لوسمیک استفاده شد. نتایج این مطالعه نشان می دهد که ترکیب سیکلوفسفامید و مهار Nrf2 با استفاده از siRNA حمل شده با نانوذرات می تواند به عنوان یک روش امیدوارکننده با مقاومت دارویی کم برای کاهش تکثیر و القای آپوپتوز در لوسمی لنفوبلاستیک مزمن استفاده شود. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
