تهیه نانوالیاف پلی کاپرولاکتون/ ژلاتین حاوی عصاره بادام تلخ و شیرین به منظور تمایزاستخوانی سلولهای بنیادی پالپ دندان

مجریان: رویا صالحی قره ورن

خلاصه روش اجرا: 1-1- تهیه ی عصاره بادام تلخ و شیرین به منظور عصاره گیری از بادام حدود یک کیلو گرم بادام تلخ و یک کیلوگرم بادام شیرین آسیاب شده سپس هر کدام جداگانه در متانول به مدت 48 ساعت در دمای 60 درجه بازروانی گردید. عصاره های حاصل با روش فریزدرایر خشک شده ودر یخچال نگهداری شد. 1-2-تهیه ی محلول های مورد استفاده برای الکترواسپینیگ 1-2-1-محلول (w/w) 15% از پلی کاپرولاکتون در مخلوط اسید استیک/اسید فرمیک تهیه گردید. بدین منظور75/0 گرم ازPCl در 5 میلی لیتر اسیداستیک / اسید فرمیک به نسبت 1:9 اضافه شده کاملاً حل گردید. بمنظور دستیابی به محلول یکنواخت، مخلوط به مدت 24 ساعت همزده شد. 1-2-2-محلول(w/w) 10% از ژلاتین در اسید استیک/ اسید فرمیک تهیه گردید. بمنظور دستیابی به محلولی یکنواخت مخلوط به مدت 2 ساعت همزده شد. 1-2-3- محلول (w/w) %15و %10، %5 از عصاره بادام تلخ و بادام شیرین تهیه شد. به منظور دستیابی به محلولی یکنواخت، مخلوط به مدت 2ساعت همزده شد. 1-3- تهیه محلول تزریقی به دستگاه محلول¬های مختلف، با نسبت¬ها و غلظت¬های متفاوت بمنظور تهیه ی نانوفیبرها مورد استفاده قرار گرفت . اما بسیاری از آنها ایراداتی از قبیل تشکیل جت پایدار، عدم تشکیل فیبر و ... بودند. بهترین سیستم بدست آمده برای الکترواسپینیگ با تغییر نسبت های مختلف /PCl/Gelatin عصاره بادام تلخ و شیرین بدست آمد. 2- تهیه¬ی نانوالیاف پلیمری حاوی عصاره بادام تلخ و شیرین با استفاده از روش الکترواسپینینگ شرایط و پارامترهای دستگاه الکترواسپینینگ چندین نوع شرایط با پارامترهای مختلف برای تهیه نانوفیبرها بکار گرفته شد. پارامترهایی از قبیل سرعت تزریق، ولتاژاعمالی، فاصله نازل تا جمع کننده مورد دستکاری قرار گرفتند تا بهترین شرایط برای الکترواسپینیگ بدست آید. در نهایت شرایط با پارامترهای زیر، به عنوان شرایط ایده¬آل بمنظور ایجاد جت پایدار و تشکیل نانوفیبرها انتخاب گردید. 1--2-سوزن تزریق سوزن مورد استفاده از جنس استیل بوده است. 2-2-جمع کننده از آنجاییکه آلومینیوم دارای رسانایی مناسب می¬باشد، فویل آلومینیومی به عنوان جمع کننده انتخاب گشت و پس از هر بار استفاده، فویل جدید و تمیز بکار گرفته شد. برای این کار ورقههای تمیز و کاملاً صاف فویل آلومینیومی به منبع ولتاژ بالا متصل شده و دقیقاً در مقابل نازل (سوزن تزریق) قرار داده شدند. 2-3-سرعت تزریق محلول پلیمری با سرعت یکنواختی که توسط پمپ اعمال می¬شد، تزریق گردید. این سرعت حدود ml 0.1 بود. 2-4-فاصله ی سوزن تا جمع کننده فاصله از نوک نازل تا جمع¬کننده در 14 سانتیمتر تنظیم گردید. 2-5-ولتاژ اعمالی ولتاژ بکار گرفته در فرایند الکترواسپینیگ در حدود 25-20 کیلوولت بود. پس از انجام الکترواسپینیگ و نشتن نانوفیبرها روی فویل آلومینیومی، فویل¬ها از دستگاه باز شده و بمدت 1 ساعت بحال خود رها شدند تا در صورت وجود حلال، کاملاً خشک شوند. -کشت سلولهای بنیادی و انتقال سلولها بر روی نانوالیاف پلیمری داربست ها را بعد از استریل کردن در پلیت های 24 خانه قرار داده و سلولهای بنیادی با محیط کشت به آن اضافه می کنیم. بعد از توالی های زمانی 24و48و72و120و 168 ساعت محیط کشت داخل خانه ها را به آرامی برداشته و محلول MTT اضافه می کنیم و به مدت 4 ساعت در انکوباتور قرار می دهیم . سپس محلول را خارج و DMSO به خانه ها اضافه می کنیم و محلول 24 خانه ها را بعد رنگ گرفتن به 96 خانه منتقل کرده و با الایزاریدر OD ها را می خوانیم. همچنین زیست سازگار بودن داربستها را با تست DAPI بررسی می نمائیم. سلولهای بنیادی بر روی تک تک به مدت 7و14و21 روز کاشته شده و رشد و تکثیروچسبندگی سلول بر روی داربست هایمان را با استفاده از روشهای آلکالین فسفاتاز،آلایزاریدر، RT-PCR و مشاهده مورفولوژی را با SEM بررسی خواهیم کرد.