اثر تزریق وریدی سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر تغییرات بافتی، استریولوژیک و میزان آپوپتوز بیضه و پارامترهای اسپرم در موش های صحرایی دیابتی نوع دو
Effect of intravenous injection of bone marrow derived c-kit⁺ cells on testicular histological and stereologic changes, apoptosis rate, and sperm parameters in type 2 diabetic rats.
مجریان: رعنا کیهان منش , فریبا قیاسی
خلاصه روش اجرا: در این مطالعه، 58رت نر با نژاد Wistar در محدوده وزنی 220-180 گرم طبق گروههای زیر (12 رت در هر گروه) مورد بررسی قرار خواهند گرفت: 10 حیوان به طور تصادفی ساده به منظور استخراج سلولهای بنیادی c-kit⁺ و c-kitˉ انتخاب شده و بقیه حیوانات به طور تصادفی ساده به گروههای زیر تقسیم می شوند: 1.گروه کنترل (C group):50 میکرولیتر محلول نرمال سالین را به صورت وریدی دریافت می کند. 2.گروه دیابتی( D group): گروه حیوانات دیابتی که 50 میکرولیتر محلول نرمال سالین را به صورت داخل وریدی دریافت می-کند. 3. گروه دیابتی + سلول c-kit⁺ (D+c-kit⁺ group): 50 میکرولیتر محلول نرمال سالین حاوی 1میلیون سلول c-kit⁺ را به صورت وریدی دریافت می¬کند. 4.گروه دیابتی + سلول c-kitˉ (D+c-kit¯ group): 50 میکرولیتر محلول نرمال سالین حاوی 1میلیون سلول c-kit¯ را به صورت وریدی دریافت می¬کند. نحوه ی القای دیابت: برای القای دیابت نوع 2 مشابه انسانی، حیوانات در گروههای دیابتی با یک رژیم غذایی با چربی بالا شامل درصدهای مشخصی از مواد شامل: آرد گندم 10%، ساکارز 20%، چربی حاصل از دنبه گوسفند 31%، کازئین 25%، مخلوط ویتامین و مواد معدنی 6%، متیونین 3/0%، مخمر نان 1/0% و کلرید سدیم 1/0% به مدت یک ماه تغذیه شده و به دنبال آن یک تزریق داخل صفاقی استرپتوزوتوسین (35mg/kg) انجام خواهد شد . جهت تشخیص و تائید دیابت، با ایجاد یک جراحت کوچک توسط لانست در دم حیوانات، یک قطره خون بر روی نوار گلوکومتری قرار داده شده و سپس توسط دستگاه گلوکومتر (Boehringer Mannheim Indianapolis,IN) نوار خواندهشده و قند خون بالای mg/dl 250 به عنوان شاخص دیابتی شدن در نظر گرفته میشود . برای تائید دیابت نوع دو تست تحمل گلوکز انجام خواهد شد. استخراج سلول های بنیادی C-kit+ و C-Kit- از مغز استخوان موش صحرایی: ابتدا 10 سر رت نر را با استفاده از دوز بالای کتامین (300mg/kg) و زایلازین (30mg/kg) کشته و استخوان های فمور حیوان را جدا می کنیم. استخوان ها را در محلول PBS حاوی 1% پنیسیلین و استرپتومایسین جهت جلوگیری از آلودگی قرار می دهیم و آن ها را به مرکز تحقیقات سلول های بنیادی انتقال می دهیم. قسمت های انتهایی استخوان را با استفاده از قیچی جدا کرده و با سرنگ 16 تا 18 و با محلول نرمال سالین استریل با تکنیک flushing محتویات مغز استخوان را داخل پلیت 10 سانتیمتری جمع آوری میکنیم. محتویات را به فالکون های 50cc منتقل کرده و پس از سانتریفیوژ با دور 1000-1500 rpm محلول رویی را دور ریخته و از سوسپانسیون ته نشین شده، سلول های تک هسته ای را با استفاده از محلولی به نام Ficoll-hypaque solution جدا می کنیم (سلول های c-kit+ در بین سلول های تک هسته ای قرار دارند). به این صورت که حجم های مساوی (2-3cc) از محلول فایکول و سوسپانسیون سلولی در فالکن 15cc میریزیم. سوسپانسیون را به آرامی و با زاویه 45-10 درجه به مایع اضافه می نماییم. سپس آن را با دور 400g و به مدت 20 تا 40 دقیقه سانتریفیوژ میکنیم. سلول های تک هسته ای بین محلول فایکول و فاز مایع قرار می گیرد که یک حالت شیری یا کدر دارد. این سلول ها را جدا کرده و چون فایکول خاصیت سمی دارد، سلول ها را شستشو می دهیم. به این طریق که محلول PBS را به این سلول ها اضافه کرده و پس از سانتریفیوژ با دور 1000-1500 rpm مایع رویی را دور می ریزیم. در این مرحله از سلول های تک هسته ای جدا شده، سلول های C-Kit+ با استفاده از روش MACS جدا خواهند شد . جدا سازی سلول های C-Kit+ و C-Kit- با استفاده از روش MACS (Magnetic Activated Cell Sorting): اساس این روش استفاده از آنتی بادی های علیه شاخص C-Kit می باشد. این آنتی بادی ها در قسمت FC (Fragment Crystalization) حاوی قطعات الکترومغناطیسی مثل آهن و نیکل می باشند. پس از اتصال آنتی بادی ها به سلول های مورد نظر، آن ها را از یک ستونی (LS column) رد می کنند که در دیواره آن خاصیت آهنربایی وجود دارد. سلول های C-Kit+ همراه با آنتی بادی ها جذب دیواره های ستون شده و سلول های C-Kit - عبور می کنند. به این ترتیب سلول های C-Kit+ و- C-Kit از هم جدا می شوند.سپس از هرکدام از این سلول ها با استفاده از لام نئوبار1میلیون سلول جدا می نماییم. تعیین هویت سلول های C-Kit+ و - C-Kit با استفاده از روش FACS(Flourecence- Activated Cell Sorting): پس از جدا سازی تعیین هویت سلول های C-Kit+ با استفاده از روش FACS انجام می شود. این کار با روش فلوسایتومتری و با استفاده از آنتی بادی های حاوی فلورسنت ضد C-Kit+ صورت می گیرد. به این صورت که آنتی بادی مذکور را به سلول های C-Kit+ اضافه کرده و به مدت 40-20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه می کنیم. سپس با استفاده از دستگاه Facscalibur و نرم افزار Flowjo درصد سلول های C-Kit+ را میسنجیم. در حالت نرمال درصد این سلول ها باید بالای 85% باشد. تزریق سلول های C-Kit+ استخراج شده: بعد از بیهوش کردن حیوانات با کتامین mg/kg 80 و زایلازین mg/kg 10، تزریق طبق گروه بندی انجام شده بصورت داخل وریدی انجام خواهد شد. 60 روز بعد (زمان لازم برای طی روند اسپرماتوژنز) مطالعات زیر انجام خواهد شد . در این مدت قند خون بطور منظم اندازه گیری خواهد شد. پس از اتمام مداخلات، حیوانات با تزریق داخل صفاقی کتامین mg/kg 80 و زایلازین mg/kg 10، بیهوش شده و بلافاصله بیضه چپ برای تغییرات بافت شناسی خارج و در فرمالین 10%تثبیت خواهد شد. همچنین بیضه راست خارج شده و برای بررسی تغییرات استریولوژیک، پارامترهای اسپرم و میزان آپوپتوز مورد استفاده قرار خواهد گرفت. سپس حیوانات با تزریق دوز بالای کتامین(300mg/kg) و زایلازین(30mg/kg) کشته و لاشه تمامی حیوانات در داخل کیسه زباله در بسته قرار گرفته و به مسئول حیوانخانه تحویل خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 64995 |
| عنوان فارسی طرح | اثر تزریق وریدی سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر تغییرات بافتی، استریولوژیک و میزان آپوپتوز بیضه و پارامترهای اسپرم در موش های صحرایی دیابتی نوع دو |
| عنوان لاتین طرح | Effect of intravenous injection of bone marrow derived c-kit⁺ cells on testicular histological and stereologic changes, apoptosis rate, and sperm parameters in type 2 diabetic rats. |
| نوع طرح | گرنت - پایان نامه |
| اولویت طرح | کاهش ناتوانی و عوارض اختلالات باروری و درمان ناباروری |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | کارشناسی ارشد |
| مدت اجرا - ماه | 14 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | در سالهای اخیر شیوع دیابت در افراد جوان افزایش پیدا کرده لذا اختلال عملکرد تولید مثلی ناشی از این بیماری در این افراد بعنوان یک چالش جدی و فوری در حال ظهور مطرح است. درمان دیابت همچنان یک چالش بزرگ است. داروهای خط اول درمان مانند متفورمین در کاهش سطح قند خون موثر بوده و به طور گسترده در بیماران مبتلا به دیابت شیرین نوع دو استفاده می شود ولی در کنترل دقیق قندخون وجلوگیری ازعوارض این بیماری کاملا موفق نیستند. استراتژی هایی برای بهبود مقاومت به انسولین محیطی و همزمان تقویت بازسازی سلول های بتا ممکن است گزینه های مناسب ایده آل برای دیابت شیرین نوع دو باشند. نشان داده شده است که سلول های دارای نشانگر c-Kit در توسعه و عملکرد جزایر لانگرهانس، به خصوص در حمایت از تکثیر سلول های بتا، بلوغ و بقای آن اهمیت دارند. یکی از مکانیسمهایی که احتمال میدادند سلولهای+ c-kit عملکرد بهبود دهندگی خود را اعمال کنند از طریق مسیر پاراکرینی است و عقیده داشتند که این سلولها با ترشح سایتوکینها و فاکتورهای رشد اعمال اثر مینمایند. اما با مطالعاتی که انجام شده تمایز سلولهای c-kit+ به انواع سلولها و ترمیم ناحیه آسیب دیده در بافتهای مختلف نیز مورد توجه قرار گرفته است. تکثیر، مهاجرت و بقای سلول های زایا در تمام مراحل اسپرماتوژنز تحت تأثیر عوامل سیگنال سلول های بنیادی از طریق گیرنده c-Kit قرار می گیرند که بیان و عملکرد آنها برای عملکرد طبیعی تولید مثل مردان بسیار حیاتی است. در میان بسیاری از عوامل نظارتی که به شدت اسپرماتوژنز را کنترل می کنند، تعامل پروتئین گیرنده کیت (c-kit) با لیگاند آن، کیتل (همچنین به عنوان لیگاند کیت و فاکتور سلول های بنیادی (stem cell factor (SCF) نامیده می شود) نقش اساسی دارد. مطالعات نشان داده اند که سلول های بنیادی توانایی عبور از سد خونی بیضوی و نشست (homing) در سلول های زایای بیضه را دارند. از طرفی دیابت موجب آسیب سد خونی- بیضه ای و افزایش نفوذپذیری در سد خونی بیضوی می شود و به این ترتیب امکان عبور سلول های ⁺c-kit از سد فراهم می شود. با توجه به اهمیت یافتن روشی برای درمان اختلال عملکرد تولید مثلی بدنبال دیابت و مشخص نبودن مکانیسم اثر سلول های بنیادی ⁺c-kit در این خصوص، برآن شدیم که اثر تزریق سلولهای بنیادی ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان را بر تغییرات بافتی، استریولوژیک، پارامترهای اسپرم و میزان آپوپتوز در بیضه موش های صحرایی دیابتی نوع دو بررسی کنیم. |
| اهداف اختصاصی | تعیین اثر سلولهای ⁺ c-kit استخراج شده از مغز استخوان برتغییرات بافتی در بیضه رت های دیابتی نوع دو -تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر تغییرات استریولوژیک دربیضه رت های دیابتی نوع دو -تعیین اثر سلولهای ⁺c-kit استخراج شده از مغز استخوان بر پارامترهای اسپرم دررت های دیابتی نوع دو - تعیین اثر سلولهای بنیادی ⁺ c-kitاستخراج شده از مغز استخوان برروی میزان آپوپتوز در بیضه رت های دیابتی نوع دو |
| چکیده انگلیسی طرح | In this study, 58 Wistar male rats in the weight range of 180-220 g will be studied according to the following groups (12 rats in each group): The 10 animals were randomly selected to extract c-kit⁺ and c-kitˉ stem cells and the remaining animals were randomly divided into the following groups; 1.Control group (C group): receiving 50 µl of normal saline solution intravenously. 2. Diabetic group (D group): diabetic animals receiving 50 µl of normal saline solution intravenously. 3. Diabetic c-kit⁺ cell group (D c-kit⁺ group): diabetic animals receiving 50 µl of normal saline solution containing 1 million c-kit⁺ cells intravenously. 4. Diabetic c-kitˉ cell group (D c-kit¯ group): diabetic animals receiving 50 µl of normal saline solution containing 1 million c-kit¯ cells intravenously. How to induce diabetes: For induction of human-like type 2 diabetes, animals in the diabetic groups will feed with a high-fat diet contained certain percentages of substances including: Wheat flour 10%, sucrose 20%, sheep fat 31%, casein 25%, vitamin and mineral blend 6%, methionine 0.3%, bread's yeast 0.1% and sodium chloride 0.1%. After one month, streptozotocin (35mg/kg) will be injected intraperitoneally. To diagnose and confirm diabetes, a small lesion was injected into the animal's tail by a lancet, a blood drop was placed on a glucometer tape and then read through a glucometer (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN) and blood glucose above 250 mg/dl. It is considered an indicator of diabetes. Glucose tolerance tests will be performed to confirm type 2 diabetes. Extraction of C-kit + and C-Kit- Stem Cells from Rat Bone Marrow Isolation of C-Kit + and C-Kit- Cells Using MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) Identification of C-Kit + and - C-Kit Cells Using FACS (Flourecence- Activated Cell Sorting) Injection of extracted C-Kit + cells |
| کلمات کلیدی | سلولهای ⁺c-kit⁺: c-kit پروتئینی است که در سطح بسیاری از انواع مختلف سلول وجود دارد که به فاکتور سلول های بنیادی (SCF) متصل می شود و باعث رشد برخی سلول های خونی می شود. C-kit نوعی از گیرنده تیروزین کینازی است. همچنین به آن CD117 و گیرنده فاکتور سلولهای بنیادی گفته می شود. سلول های دارنده ی این گیرنده، c-kit+ نامیده میشوند. آپوپتوز: نوعی از مرگ سلولی برنامه ریزی شده ای که در موجودات چند سلولی رخ می دهد .وقایع بیوشیمیایی منجر به تغییرات سلولی مشخصه (مورفولوژی) و مرگ می شوند. دیابت نوع 2: نوعی اختلال در سوخت و ساز بدن است که با بالا بودن گلوکز خون در شرایط مقاومت در مقابل انسولین و کمبود نسبی انسولین شناسایی میشود. |
| ذینفعان نتایج طرح | بیماران دیابتی نوع 2 که اختلال در باروری دارند. جامعه و سیاستگذاران زیرا هزینه های مربوط به درمان ناباروری و تکنیکهای کمک باروری کاهش می یابد. |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| رعنا کیهان منش | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| فریبا قیاسی | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| فاطمه عابدینی | دانشجوی مالک پایان نامه |
| غلامرضا حمیدیان | مشاور |
| رضا رهبرقاضی | مشاور |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر سلولهای C-kit باعث بهبود باروری در رتهای نر مبتلا به دیابت می شود.متن خبر دیابت منجر به افزایش ناباروری در جنس مذکر می گردد. درمانهای مختلفی برای بهبود ناباروری ناشی از دیابت پیشنهاد شده است که یکی از جدیدترین و بهترین روش ها استفاده از سلولهای
C-kit می باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که تزریق سلولهای C-kit باعث بهبود میزان باروری در رتهای نر مبتلا به دیابت می شود. سلولهای C-kit باعث بهبود پارامترهای اسپرم، کاهش میزان شکست DNA، بهبود تغییرات بافتی و استریولوژیک در بیضه موشهای صحرایی دیابتی نوع دو می شود. با توجه به شیوع دیابت و مشکلات باروری ناشی از آن، این نتایج امیدها را بیشتر می کند تا سلولهای C-kit بتوانند از طریق افزایش تحرک، زنده مانی و تعداد اسپرم های نرمال و کاهش شکست DNA اسپرم و بهبود تغییرات استریولوژیک و بافتی در بیضه در درمان باروری مبتلایان به دیابت مفید باشد. سلولهای C-kit می توانند هدف خوبی جهت پژوهشهای مختلف در حوزه درمان اختلالات باروری مردان دیابتی باشند. |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر سلولهای C-kit باعث بهبود باروری در رتهای نر مبتلا به دیابت می شود.متن خبر دیابت منجر به افزایش ناباروری در جنس مذکر می گردد. درمانهای مختلفی برای بهبود ناباروری ناشی از دیابت پیشنهاد شده است که یکی از جدیدترین و بهترین روش ها استفاده از سلولهای
C-kit می باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که تزریق سلولهای C-kit باعث بهبود میزان باروری در رتهای نر مبتلا به دیابت می شود. سلولهای C-kit باعث بهبود پارامترهای اسپرم، کاهش میزان شکست DNA، بهبود تغییرات بافتی و استریولوژیک در بیضه موشهای صحرایی دیابتی نوع دو می شود. با توجه به شیوع دیابت و مشکلات باروری ناشی از آن، این نتایج امیدها را بیشتر می کند تا سلولهای C-kit بتوانند از طریق افزایش تحرک، زنده مانی و تعداد اسپرم های نرمال و کاهش شکست DNA اسپرم و بهبود تغییرات استریولوژیک و بافتی در بیضه در درمان باروری مبتلایان به دیابت مفید باشد. سلولهای C-kit می توانند هدف خوبی جهت پژوهشهای مختلف در حوزه درمان اختلالات باروری مردان دیابتی باشند. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر سلولهای C-kit باعث بهبود باروری در رتهای نر مبتلا به دیابت می شود.متن خبر دیابت منجر به افزایش ناباروری در جنس مذکر می گردد. درمانهای مختلفی برای بهبود ناباروری ناشی از دیابت پیشنهاد شده است که یکی از جدیدترین و بهترین روش ها استفاده از سلولهای
C-kit می باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که تزریق سلولهای C-kit باعث بهبود میزان باروری در رتهای نر مبتلا به دیابت می شود. سلولهای C-kit باعث بهبود پارامترهای اسپرم، کاهش میزان شکست DNA، بهبود تغییرات بافتی و استریولوژیک در بیضه موشهای صحرایی دیابتی نوع دو می شود. با توجه به شیوع دیابت و مشکلات باروری ناشی از آن، این نتایج امیدها را بیشتر می کند تا سلولهای C-kit بتوانند از طریق افزایش تحرک، زنده مانی و تعداد اسپرم های نرمال و کاهش شکست DNA اسپرم و بهبود تغییرات استریولوژیک و بافتی در بیضه در درمان باروری مبتلایان به دیابت مفید باشد. سلولهای C-kit می توانند هدف خوبی جهت پژوهشهای مختلف در حوزه درمان اختلالات باروری مردان دیابتی باشند. |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر سلولهای C-kit باعث بهبود باروری در رتهای نر مبتلا به دیابت می شود.متن خبر دیابت منجر به افزایش ناباروری در جنس مذکر می گردد. درمانهای مختلفی برای بهبود ناباروری ناشی از دیابت پیشنهاد شده است که یکی از جدیدترین و بهترین روش ها استفاده از سلولهای
C-kit می باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که تزریق سلولهای C-kit باعث بهبود میزان باروری در رتهای نر مبتلا به دیابت می شود. سلولهای C-kit باعث بهبود پارامترهای اسپرم، کاهش میزان شکست DNA، بهبود تغییرات بافتی و استریولوژیک در بیضه موشهای صحرایی دیابتی نوع دو می شود. با توجه به شیوع دیابت و مشکلات باروری ناشی از آن، این نتایج امیدها را بیشتر می کند تا سلولهای C-kit بتوانند از طریق افزایش تحرک، زنده مانی و تعداد اسپرم های نرمال و کاهش شکست DNA اسپرم و بهبود تغییرات استریولوژیک و بافتی در بیضه در درمان باروری مبتلایان به دیابت مفید باشد. سلولهای C-kit می توانند هدف خوبی جهت پژوهشهای مختلف در حوزه درمان اختلالات باروری مردان دیابتی باشند. |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
