بررسی سمیت سلولی و مکانیسم اثر ساپونین خالص گیاهی Buddlejasaponin IVa بر روی سلولهای سرطان دهان

مجریان: ساناز حامدیزدان

خلاصه روش اجرا: اندام هوایی Clinopodium umbrosum در اواخر فصل بهار از مناطق جنگلی استان مازندران جمع آوری شده و در شرایط آزمایشگاهی خشک می شود. پس از پودر شدن به ترتیب توسط حلال های ان-هگزان، کلروفرم و متانول به روش سوکسله عصاره گیری می شود. پس از خشک نمودن عصاره ها تحت خلا، کنترل کیفی آنها توسط TLC صورت می گیرد. به منظور فراکسیونه کردن و جداسازی ماده مؤثره از عصاره متانولی به ترتیب از انواع روش های کروماتوگرافی شامل SPE، VLC و HPLC استفاده می گردد. در روش SPE از کارتریج های سیلیکاژل حاوی بستر فاز ساکن ODS استفاده خواهیم نمود که در این روش دوگرم از عصاره متانولی گیاه توزین و شست و شوی آن روی کارتریج توسط مخلوط های 10%، 20%، 40%، 60%، 80% و 100%متانول در آب هریک به میزان 200 میلی لیترانجام خواهد شد. با انجام TLC و بررسی تمامی فراکسیونها، فراکسیون اصلی حاوی ماده مؤثره برای جداسازی و خالص سازی ترکیب انتخاب می گردد. در این راستا برای فراکسیونه کردن بیشتر فراکسیون اصلی SPE از روش کروماتوگرافی VLC  استفاده حواهد شد که در این روش نیز فراکسیونه ردن بر روی فاز ساکن سیلیکاژل انجام خواهد شد. بدین ترتیب که پس از بار گذاری فراکسیون انتخاب شده بر روی ستون سیلیکاژل، شست و شو و فراکسیونه کردن به ترتیب توسط مخلوط حلالهای کلروفرم-متانول(5-95) الی 100 متانول هریک به میزان 100 میلی لیتر انجام خواهد شد. بررسی ساب فراکسیون ها نیز توسط TLC صورت می گیرد، ساب فراکسیونهای مشابه مخلوط وساب فراکسیون های حاوی ترکیبات اصلی به منظور جداسازی و خالص سازی ماده مؤثره اصلی با روش HPLC آنالیتیکال ابتدا بررسی و سپس پره پراتیو جداسازی می گردند. پس از جمع آوری ترکیبات خالص در دستگاه روتاری اواپراتور خشک می گردد. شناسایی ساختار شیمیایی ترکیبات خالص بدست آمده با روشهای مختلف اسپکتروسکوپی NMR ( تک بعدی و دوبعدی) مورد شناسایی قرار خواهند گرفت.. به منظور بررسی مکانیسم اثر ماده موثره بر روی سلولهای سرطانی، سلولهای HN5 (که low passage می باشد) بصورت تک لایه در محیط DMEM با گلوکز بالا حاوی سرم 10% (FBS یا Fetal Bovin Serum) و آنتی بیوتیک کشت داده شده و پس از رسیدن به سطح Confluency ، با ماده موثره مواجه می شوند. سپس RNA از سلول های مزبور استخراج خواهد شد. با استفاده از 1 میکرو گرم RNA واکنش RT ست می گردد. واکنش در دستگاه ترموسایکلر بر طبق برنامه دمایی خاص آغاز می شود. در ادامه با استفاده از روش Real time-PCR نسخه های ژنهایcaspase 8,9 بررسی و تعیین مقدار می شود. بطور خلاصه برای هر ژن یک جفت Primer طراحی شده و با استفاده از 10 نانوگرم cDNA ، بافر، پرایمرها، کلرید منیزیم، dNTP’s و آنزیم Tag-Polymerase واکنش PCR آماده می گردد. لازم به توضیح است که برای کنترل تغییرات بین نمونه ای، از Housekeeping Gene ß-Actin استفاده خواهد شد و از نسبت دانسیته ژن مورد نظر بر ß-Actin برای گزارش نتایج استفاده خواهد شد.