بررسی اثر مهار ژن های BMP4 و P21 با SiRNA کمپلکس شده با اگزوزوم بر مسیر پیام رسانی Wnt و تمایز سلول های بنیادی عصبی SH - SY5Y

مجریان: محمد نوری , علیرضا نورآذریان

خلاصه روش اجرا: در این طرح برای انتقال siRNA ها به سلول بنیادی عصبی sh-y5y از نانوذراتی به نام اگزوزوم ها استفاده خواهد شد. اگزوزوم ها ذراتی به ابعاد 20 – 120 نانومتر می باشند که از سلول ها به مایع اطراف ترشح می گردند و در اغلب مایعات بیولوژیک بدن و محیط کشت اطراف سلول ها وجود دارند. با توجه به این که اگزوزوم ها می توانند حاوی پروتئین و RNA باشند، نقششان به عنوان messenger می باشد. استخراج اگزوزوم ها توسط کیتی با عنوان miRCURYTM Exosome Isolation Kit صورت خواهد گرفت. نحوه ی استخراج بصورت زیر است: - ابتدا با اسپین محیط کشت سلول هایمان، سلول های مرده و debri ها را جدا می کنیم. - در مرحله دوم بافر مخصوص رسوب دهنده در داخل کیت را به نمونه اضافه کرده و 60 دقیقه در دمای 4 درجه انکوبه میکنیم. - در مرحله آخر اگزوزوم ها با دور معمولی سانتریفوژ رسوب داده می شوند، سوپرناتانت را دور ریخته و به پلت بجا مانده PBS اضافه کرده و resuspend می کنیم. -اگزوزوم های حاصل را فریز کرده و در زمان استفاده ذوب می کنیم. جهت اتصال siRNA ها به اگزوزوم ها و افزایش کارایی انتقال ژن از کیت دیگری تحت عنوان ExoFectionsiRN A-into-Exosom Kit(chemical) استفاده می شود. این کیت حاوی دو بافر مکمل و معرف ExoFection می باشد، که مانع به هم چسبیدن siRNA ها شده و بعد از طی زمان انکوباسیون بصورت overnight در 37 درجه، siRNA ها به داخل اگزوزوم ها ترانسفکت خواهند شد. برای تعیین سمیت siRNA های ژن های BMP4 و P21 از تست MTT استفاده می کنیم .ابتدا siRNA ها را در 10 میکرو لیتر بافر تریس با PH=7 به همراه محیط کشت فاقد هیچ سرم، پروتئین و آنتی بیوتیکی حل کرده تا حجم کل به 150 میکرولیتر برسد. محلول حاصل را چند ثانیه تکان می دهیم تا قطرات بالای لوله حذف شود.در مرحله بعدی با اضافه کردن 20 میکرولیتر از معرف اگزوزوم به siRNA های ژن های BMP4 و P21مربوطه ، خوب مخلوط کرده و 5-10 دقیقه در حرارت اتاق برای انکوباسیون قرار می دهیم تا transfection-complex تشکیل شود،سپس با اضافه کردن 1 میلی لیتر محیط کشت سلول حاوی سرم و آنتی بیوتیک به آن ، خوب به هم زده و بلافاصله transfection complexes را قطره قطره روی سلول ها اضافه کرده و به آهستگی تکان می دهیم تا روی پلیت به صورت منظم پخش شود بعد از این مرحله سلول ها را به همراه transfection-complex تحت شرایط کشت سلول(5% CO2 ، دمای 37 درجه) 24-48 ساعت انکوبه کرده و پس از آن با روش MTT assay میزان سمیت نانوداروی ژنی را بررسی می کنیم، بدین صورت که پس از عمل ترانسفکشن ، سلول ها را با PBS استریل شستشو می دهیم و سپس با عوض کردن محیط کشت با محیط کشت جدید حاوی [3-(4,5-dimethyl thiazolyl-2)2,5 diphenyl tetrazolium bromide] یا MTT آن را به مدت 4 ساعت انکوبه می کنیم سپس با خارج کردن محیط کشت، سلول ها را در برابر DMSOو Sorenson’s buffer (pH 7.4) قرار می دهیم و به مدت 30 دقیقه در دمای ْ37 انکوبه می کنیم و سپس میزان جذب آن را در طول موج nm 570 بوسیله دستگاه plate reader می خوانیم . جهت شمارش سلول های زنده، سلول های حاصل از کشت را پس از عمل تفکیک سلولی با Trypsin/EDTA با رنگ تریپان بلو مخلوط کرده و پس از 5 دقیقه، مقداری از نمونه را به روی لام نئوبار انتقال داده و تعداد سلول های زنده (سلول هایی که رنگ را به خود جذب نکرده اند) را شمارش می کنیم و درصد سلول های زنده را محاسبه می کنیم . ب) جدول متغیرها (Variables): ج) روش تجزیه و تحلیل آماری داده ها ( روش آنالیز آماری مد نظر است نه صرفاً ‌نرم افزار مورد استفاده ) برای آنالیز آماری (ANOVA) نرم افزار GraphPad Prism مورد استفاده قرار خواهد گرفت. روش دوم: الف) خلاصه ی روش اجرا: برای تعیین میزان ورود و جذب نانوذره های نشاندار شده با فلوروفور مناسب نظیر فلوروسین یا FITC در سلول های بنیادی عصبی با استفاده از روش میکروسکوپ فلوروسانس و همچنین با روش flow cytometry بررسی می کنیم در فلوسایتومتری از آنتی بادی ضد CD63 که اختصاصی سلول های بنیادی هستند و در سطح سلول بنیادی واقع شده است، استفاده می نماییم. بدین صورت که بعد از عمل ترانسفکشن ، سلول ها را با PBS استریل شستشو می دهیم سپس سلول ها را توسط Trypsin/EDTAاز یکدیگر تفکیک می کنیم سپس محیط کشت به آن اضافه کرده و به لوله هایFACS در حالی که لوله ها روی یخ هستند، منتقل می کنیم و سریعا آن را در فلوسیتومتری مورد آنالیز قرار می دهیم. به منظور بررسی میکروسکوپ فلورسنت، سلولها پس از کشت در زمان مناسب، توسط siRNA نشاندار شده تیمار و پس از 5 ساعت سه بار توسط PBS شسته شده سپس در فرمالدهید 2% به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق ثابت خواهند شد . پس از 3 بار شستشوی مجدد توسط PBS بوسیله رنگ آمیزی هسته یا DAPI، رنگ آمیزی و بوسیله میکروسکوب فلورسنت مطالعه خواهیم کرد. برای رنگ آمیزی DAPI ابتدا سلول‌ها‌ با l/well μ 60 پارافوم آلدئید 4% ثابت شده سپس توسط یک دستمال کاغذی از روی سطح سلول‌ها‌ برداشته شده، در مرحله بعدی سلول‌ها‌ با l/well μ 60 از محلول PBS، 3 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه شسته خواهند شد و به همان حجم از تریپتون 1/0 % روی آنها اضافه خواهد شد، بعد از تکرار مراحل شستشو بروی سلول‌ها‌ حدود l/well μ 50 از محلول رنگ آمیزی اضافه کرده و پس از شستشو برای بررسی با میکروسکوپ فلورسنت مورد استفاده قرار خواهند گرفت. ب) جدول متغیرها (Variables): ج) روش تجزیه و تحلیل آماری داده ها ( روش آنالیز آماری مد نظر است نه صرفاً ‌نرم افزار مورد استفاده ) در صورت نیاز برای آنالیز آماری (ANOVA) نرم افزار GraphPad Prism مورد استفاده قرار خواهد گرفت. و همین طور برای تعیین اثر siRNA ژن های BMP4 و P21 بر میزان بیان ژن های BMP4، P21 ، NeuroD1 و Prox1 قبل و بعد از ژن تراپی در سلول های بنیادی عصبی sh-y5y از روش Real Time PCR استفاده خواهد شد به این ترتیب که ابتدا استخراج RNA از سلول های مورد نظر طبق پروتکل Tri-reagentانجام خواهد شد و 2میکروگرم از RNAاستخراج شده با استفاده از پروتکل موجود در منابع برای سنتز cDNAاستفاده خواهد شد. سپس محصول cDNA رقت سازی شده و برای بررسی میزان بیان ژن های BMP4، P21 ، NeuroD1 و Prox1 از دستگاه Real Time PCR استفاده خواهد شد.cDNA استاندارد از گروه کنترل تهیه می کنیم و برای ترسیم نمودار استاندارد با استفاده از رقت سازی مورد استفاده قرار خواهد گرفت.همچنین تمامی نمونه ها به صورت سه تایی (triplicate) با استفاده از روش سایبرگرین Real Time PCR خواهند شد.پس از انجام Real Time PCR میانگین CTهای نمونه های مورد مطالعه با استفاده از فرمول ارائه شده توسط pfaffl و توسط excel آنالیز خواهد شد. ب) جدول متغیرها (Variables): ج) روش تجزیه و تحلیل آماری داده ها ( روش آنالیز آماری مد نظر است نه صرفاً ‌نرم افزار مورد استفاده ) آنالیز داده‌های‌ حاصل از Real-time PCR به روش relative quantification و با استفاده از متد Delta Delta CT انجام شد.در این روش مقدار Ct مربوط به ژن‌های‌ مورد مطالعه در نمونه مورد نظر با نمونه کنترل مقایسه می‌شود و این مقادیر Ct با مقادیر بدست آمده از ژن housekeeping یا مرجع نرمالایز می‌شود. روش سوم: الف) خلاصه روش اجرا: برای تعین میزان کارایی siRNA ژن های BMP4 و P21 بطور جداگانه در مهار بیان ژن های BMP4 و P21 در سطح پروتئومیکس از تکنیک Western blot استفاده می کنیم به این طریق که بعد از تخلیص پروتئین ها ، ابتدا آنها را با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل پلی آکریل آمید جدا کرده (بر اساس پروتوکل روش PAGE) و سپس ژل را در بافر انتقال دهنده (Transfer buffer) از روی ژل به کاغذهای PVDF منتقل می کنیم. سپس صفحات PVDF را در بافر مخصوص بلوکه می نماییم. در مرحله بعد صفحات را به مدت یک شب در بافر حاوی آنتی بادی اولیه ضد پروتئین مورد نظر قرار می دهیم و پس از شستشو با بافر PBS، آنتی بادی ثانویه نشاندار با آنزیم پراکسیداز را به آن اضافه می نماییم. تشخیص وجود پروتئین با افزودن سوبسترای آنزیم به غشاء ها صورت می گیرد. کلیه بافرها اعم از بافر ژل های Stacking و Resolving پلی اکریلامید، بافر تانک الکتروفورز، بافر نمونه، بافر حرکت دهنده نمونه در الکتروفورز ، بافر ترانسفر، بافر شستشو، بافر بلوکه کننده، بافر رقیق کننده آنتی بادی، ، محلول رنگی سوبسترا، تماما ً طبق پروتوکل ارائه شده در کتب و رفرانس های مذکور با خرید پودرها و محلول های مربوطه در آزمایشگاه ساخته خواهند شد. ب) جدول متغیرها (Variables): ج) روش تجزیه و تحلیل آماری داده ها ( روش آنالیز آماری مد نظر است نه صرفاً ‌نرم افزار مورد استفاده ) به کمک نرم افزار Image J نتایج آنالیز خواهند شد .