بررسی تاثیر مهار CD73 در سلول های لوسمی لنفوسیتی مزمن توسط نانوذرات بارگیری شده با مولکول siRNA بر اثرات سایتوتوکسیک Fludarabine
Investigating the impact of CD73 inhibition on chronic lymphocytic leukemia cells by siRNA molecule loaded nanoparticles on the cytotoxic effects of Fludarabine
مجریان: فرهاد جدیدی نیارق
خلاصه روش اجرا: مطالعه بر روی نمونه های خون محیطی ۱۰ بیمار مبتلا بهCLL تایید شده انجام خواهد شد. همچنین اطلاعات بیشتری از برخی ویژگی های بیماران مثل ناهنجاریهای ژنتیکی راجعه ، رویکردهای درمانی قبل از عود و بازگشت بیماری مربوط به بیماران remission and relapse، جنسیت بیماران و...نیز برای ارزیابی های تکمیلی جمع آوری خواهد شد . همچنین نمونههای خون محیطی از اهدا کنندگان سالم به صورت موازی و منطبق به عنوان گروه کنترل دریافت خواهد شد. سلول های PBMC بیماران با روش دانسیته گرادیان با استفاده از فایکول جداسازی خواهند شد. در این مطالعه Fludarabine و siRNA بارگیری شده در نانو ذرات به صورت Single agent و Combinational استفاده خواهد شد. این مطالعه دو فاز دارد: ۱.تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات حاوی siRNA و دارو ابتدا با واکنش کیتوزان و اسید لاکتیک ترکیب کیتوزان لاکتات را تولید می کنیم. سپس باید نانوذرات کیتوزان لاکتات RNA مداخله گر را در بر بگیرند. کیتوزان لاکتات پتانسیل بالایی برای کپسوله کردن siRNA و حفاظت از آن در برابر تخریب سرمی دارد. تشکیل نانو ذرات کیتوزان لاکتات در اثر تعاملات یونی بین کیتوزان لاکتات و siRNA حل شده در سدیم تری پلی فسفات ( siRNA/TPP ) صورت می گیرد. و نانوذرات حاوی siRNA تولید می شوند که خصوصیات فیزیکو شیمیایی آن ها بررسی می شود. تولید کمپلکس نانوذرات-siRNA با ژل اکتروفورز در ژل 2% آگارز تایید می شود. سپس میزان بارگیری siRNA به صورت کمی بوسیله روش اولتراسانتریفیوژ و بررسی جذب UV دارو بررسی خواهد شد. بررسی مورفولوژی نانوذرات با استفاده از میکروسکوپ SEM و همچنین بررسی ساختار آنها با استفاده از FTIR انجام خواهد شد. ضمن اینکه پایداری نانوذرات نیز در مقابل سرم بررسی خواهد گشت. ۲. مطالعه in vitro اثر بخشی نانو ذرات تهیه شده : از سلولهای لوسمیک خون محیطی بیماران مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک مزمن در این مطالعه استفاده خواهد شد که این سلولها در محیط RPMI1640 حاوی fetal bovine serum 10% و آنتی بیوتیک کشت داده می شوند. پس از گذشت ۲۴ ساعت از کشت سلولی، نانوذرات حاوی siRNA و دارو را به محیط کشت سلول ها اضافه می کنیم. میزان تاثیر درمان های تکی و ترکیبی بر روی بیان ژن CD73 در کشت سلول ها و همچنین، تاثیر درمان ترکیبی بر روی جلوگیری از بیان ژن های پیش برنده آپوپتوز، مهارکننده آپوپتوز، تکثیر سلولی، آنژیوژنز و متاستاز نیز توسط تکنیک Real-time PCR در فواصل زمانی مختلف بررسی می شود. برای ارزیابی تکثیر و حیات سلولی، سلولها تحت تاثیر دارو و نانوذرات مورد آزمایش تیمار می شوند و سپس پرولیفراسیون سلول ها توسط MTT تعیین می شود. برای ارزیابی اثر درمان ترکیبی بر روی آپوپتوز سلول های لوسمیک از روش آپوپتوز بوسیله رنگ آمیزی سلول ها با کیت Annexine V-FITC/PI و دستگاه فلوسایتومتری استفاده خواهیم نمود. بعد از جدا نمودن سلول های PBMC از خون محیطی بیماران، ابتدا سلول ها را به مدت 24 ساعت کشت داده و سپس ترکیبات مختلف درمانی را به سلول ها اضافه کرده و پس از 24 ساعت اثرات آپوپتوتیک را بوسیله فلوسایتومتری بررسی خواهیم نمود. آنالیز فلوسیتومتری اپوپتوز با استفاده از Propidum Iodide (PI) / Annexin V بر اساس دستور العمل سازنده انجام خواهد شد و درصد سلولهای AnnexinV/PI Positive با ارزیابی حداقل ۱۰۰۰۰ سلول تعیین خواهد شد ،میانگین درصد سلولهای Annexin V /PI Positive و خطای استاندارد حداقل در دو آزمایش مستقل محاسبه خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 64646 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی تاثیر مهار CD73 در سلول های لوسمی لنفوسیتی مزمن توسط نانوذرات بارگیری شده با مولکول siRNA بر اثرات سایتوتوکسیک Fludarabine |
| عنوان لاتین طرح | Investigating the impact of CD73 inhibition on chronic lymphocytic leukemia cells by siRNA molecule loaded nanoparticles on the cytotoxic effects of Fludarabine |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | ایمونوتراپی بیماریهای شایع با استفاده از ژن درمانی |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | دکتری عمومی |
| مدت اجرا - ماه | 14 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | سال ها است که محققان برای کشف راه های پیشگیری ، تشخیص عوامل بیماریزایی و درمان لوسمی لنفوبلاستیک مزمن ) CLL) در حال تحقیق هستند. در دهه های اخیر علی رغم پیشرفت وسیع تکنولوژی و دانش تشخیص و درمان CLL تعداد افرادی که در اثر ابتلا به این سرطان فوت می کنند کاهش چندانی نداشته است. طی سال های گذشته ، شیمی درمانی و پرتودرمانی جزء خط مقدم روش های درمانی انواع سرطان ازجمله CLLبوده اند که گاهاً نتایج امیدوار کننده ای از خود نشان داده اند ؛ اما این روش های درمانی در تعداد زیادی از بیماران نتیجه مورد قبولی نداشته اند و محدودیت هایی از جمله هزینه ی بالا برای بیمار یا سیستم درمانی ، عوارض جانبی شدید و عدم کارایی در درمان انواع پیشرفته تر CLL را دارند. ناکارآمدی این روش های درمانی محققان را بر آن داشت که به دنبال روش های درمانی جدید و یا بهبود کارائی درمان های حاضر در افزایش نرخ بقا در بیماران مبتلا به CLL باشند. از طرفی مطالعات قبلی مثمر ثمر بودن درمان های ترکیبی جدید در همراهی با داروهای شیمی درمانی همچون Fludarabine را نشان می دهد.با وجود شواهد و دیتا در مورد اثر بخشی چنین رویکردهای درمانی هنوز مطالعات کمی در خصوص بررسی مکانیسم های اثر بخشی و کارائی آنها در بدخیمی های خونی خصوصا CLL انجام شده است. از طرفی مشخص شده است که سلول های لوسمیک می توانند مولکول CD73 را بیان کنند که منجر به رشد و گسترش سرطان و مقاومت دارویی می گردد. به این ترتیب این مطالعه با نشان دادن مسیر مکانیسم عمل پیشنهادی , بر روی ارائه روشهای درمانی جدید بصورت Single target و یا با نشان دادن پیامدهای درمان های ترکیبی, بر روی پیشنهاد دادن اهداف با اثرات همیاری بصورت combination تمرکز دارد. |
| اهداف اختصاصی | تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات حاوی siRNA و دارو و ارزیابی آنها -مطالعه in vitro اثر بخشی نانوذرات بر روی بیان ژن های هدف -مطالعه in vitro اثر بخشی نانوذرات بر روی آپوپتوز سلول های لوسمیک -مطالعه in vitro اثر بخشی نانوذرات و درمان ترکیبی بر روی بقا و تکثیر سلول های لوسمیک با روش MTT -برای مقایسه آماری نتایج از آزمون آماری ONEWAY ANOVA استفاده خواهد شد. |
| چکیده انگلیسی طرح | Researchers have been investigated the ways to prevent, diagnose, and treat chronic lymphoblastic leukemia (CLL) for several years. In recent decades, despite the advances in technology and the knowledge of the diagnosis and treatment of CLL, the number of people who have died of this cancer has not decreased significantly. Over the past years, chemotherapy and radiation have been at the forefront of cancer treatments, including CLL, which have sometimes shown promising results. However, there are several limiting factors that are associated with chemotherapy including high costs for the patient or system, severe side effects and inefficiencies in the treatment of more advanced types of CLL. The ineffectiveness of these therapies led to the ridentification of new therapies or to improve the efficacy of current therapies to increase survival rates in patients with CLL.Previous studies have also shown the effectiveness of new combination therapies in combination with chemotherapy drugs such as Fludarabine. Despite the evidence and data on the efficacy of such therapeutic approaches, few studies have yet been conducted to investigate the mechanisms of their efficacy and efficacy in hematologic malignancies, especially CLL. It has been shown that the expression of CD73 in CLL cells can promote their progression and drug resistance. Thus, this study focuses on proposing novel therapeutic modalities as single targets or demonstrating the consequences of combination therapies by suggesting the mechanism of action, suggesting goals with the effects of a combination of effects. |
| کلمات کلیدی | CD73: این مولکول همچنین به عنوان ecto-5'-nucleotidase شناخته می شود وآنزیمی است که در انسان توسط ژن NT5E کد گذاری می شود. CD73 معمولا برای تبدیل AMP به آدنوزین استفاده می شود. این آنزیم شامل یک دایمر از 2 زیرواحد یکسان 70کیلودالتونی است که با پیوند گلیکوزیل فسفاتیدیل اینوزیتول به بخش خارجی غشای پلاسمایی متصل می شود. این آنزیم به عنوان مارکر تمایز لنفوسیتی استفاده می شود. کیتوزان : کیتوزان یک آمینو پلی ساکارید خطی و ترکیبی از پیوند های (۴→۱ β) واحدهای D-گلوکزآمین وN-استیل -D-گلوکزآمین است. کیتوزان توسط داستیلاسیون کیتین ( پلی ساکارید طبیعی و فراوان موجود در اسکلت خارجی سخت پوستانی همچون خرچنگ و میگو)، تهیه می شود. این پلی ساکارید کاتیونی به دلیل دسترس پذیری فراوان، چسبندگی بی نظیر، خواص دارویی مناسب و دیگرخواص سودمند بیولوژیکی مثل زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری، عدم سمیت و تحریک کم سیستم ایمنی، در موارد بیوپزشکی و دارویی مورد توجه گسترده قرارگرفته است. siRNA: RNA مداخله گر (RNAi) اصطلاح کلی است که به تکنولوژی خاموشی پس از رونویسی توسط RNA دو رشته ای اطلاق گردیده و در گیاهان با اصطلاح PTGS عنوان می شود .در تکنولوژی RNA مداخله گر (RNAi) ، رشته مکمل mRNA ژن مورد نظر ساخته شده و این رشته به mRNA ژن هدف متصل و یک توالی دورشته ای (dsRNA) را بوجود می آورد. از آنجا که سیستم سنتز پروتئین قادر به ترجمه mRNA دو رشته ای نمی باشد، بیان ژن هدف متوقف و اصطلاحاً ژن خاموش می شود. نانوذره (Nanoparticle) : ذراتی هستند که ابعاد آنها در حدود ۱ تا ۱۰۰ نانومتر است. لیپوزمها، درخت سانها، نانو ذرات پلیمری، نانو ذرات پوشش داده شده با پلیمرها، نانو ذرات کیتوزان و لستین و نانو ذرات دارویی نمونههایی از نانو ذراتی میباشند که برای دارو رسانی استفاده شده اند. Fludarabine : با نام تجاری Fludara فروخته می شود. یک داروی شیمی درمانی است که در معالجه لوسمی و لنفوم شامل لوسمی لنفوسیتی مزمن ، لنفوم غیر هوچکین ، لوسمی حاد میلوئیدی و لوسمی لنفوسیتی حاد مورد استفاده قرار می گیرد و تجویز ان به صورت خوراکی و داخل وریدی است. Chlorambucil : با نام تجاری Leukeran فروخته می شود ، یک داروی شیمی درمانی است که برای درمان لوسمی لنفوسیتی مزمن (CLL) ، لنفوم هوچکین و لنفوم غیر هوچکین مورد استفاده قرار می گیرد. یک درمان ارجح برای CLL است و تجویز ان به صورت خوراکی است. Dexamethasone: نوعی داروی کورتیکواستروئید است که در درمان بسیاری از بیماری ها از جمله مشکلات روماتیسمی ، تعدادی از بیماری های پوستی ، حساسیت شدید ، آسم ، بیماری انسداد مزمن ریه ، تورم مغز و همراه با آنتی بیوتیک ها در سل استفاده می شود. Mitoxantrone : یک مهارکننده توپوایزومراز نوع II است که سنتز و ترمیم DNA در سلولهای سالم و سرطانی را از طریق برهمکنش بین جفت بازهای DNA مختل می کند. همچنین به عنوان آنتی بیوتیک طبقه بندی می شود. Cyclophosphamide : که به عنوان سیتوفسفان نیز شناخته می شود ، دارویی است که به عنوان شیمی درمانی برای درمان لنفوم ، مولتیپل میلوما ، لوسمی ، سرطان تخمدان ، سرطان سینه ، سرطان ریه سلول کوچک ، نوروبلاستوما و سارکوم و همچنین برای سرکوب سیستم ایمنی بدن مورد استفاده قرار می گیرد. Rituximab : یک آنتی بادی مونوکلونال کایمریک در برابر پروتئین CD20 (در سطح لنفوسیت های B) است. اتصال ریتوکسیماب به این پروتئین باعث القای اپوپتوز و مرگ سلولی می شود. Cytarabine : به عنوان سیتوزین آرابینوزید (ara-C) نیز شناخته می شود ، یک داروی شیمی درمانی است که برای درمان لوسمی میلوئید حاد (AML) ، لوسمی لنفوسیتی حاد (ALL) ، لوسمی میلوژن مزمن (CML) و لنفوم غیر هوچکین مورد استفاده قرار می گیرد.تجویز ان به صورت تزریق داخل وریدی ، زیر پوستی یا مایع مغزی نخاعی است. |
| ذینفعان نتایج طرح | بیماران لوسمی |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| فرهاد جدیدی نیارق | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| بهزاد برادران | مشاور |
| مهسا یوسفی بستان اباد | دانشجوی مالک پایان نامه |
| شفا اصغرنیا | همکار اصلی |
| سپیده ایزدی | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر درمان ترکیبی لوسمی لنفوسیتی مزمن بر پایه مهار CD73 و انتقال دوکسوروبیسن موجب آپوپتوز سلول های بدخیم می شود.متن خبر لوسمی لنفوسیتی مزمن ( CLL) رایج ترین نوع لوسمی در کشورهای غربی محسوب می شود. علی رغم حصول پیشرفت های فراوان در درمان انواع لوسمی ها، هنوز هم درمان قطعی برای درمان بیماران CLLوجود ندارد.فلودارابین یکی از داروهای انتخابی در درمان بیماران CLL است که در بسیاری از بیماران با مقاومت مواجه می شود. بنابراین در این مطالعه تصمیم گرفته شد با مهار بیان مولکول CD73 در سلول های لوسمیک، حساسیت این سلول ها به درمان با داروی فلودارابین را افزایش دهیم. در این مطالعه ما از نانوذرات اکسید آهن سوپرپارامغناطیسی (SPION) بار گیری شده باsiRNA به منظور مهار بیان ژن CD73 و انتقال همزمان داروی فلودارابین استفاده نمودیم.نانوذرات بارگیری شده با siRNA CD73 و فلودارابین می توانستند بطور موثری بیان مولکول CD73 را در سلول های لوسمیک مهار گنند. همچنین درمان ترکیبی توانست بصورت معناداری حساسیت سلول های لوسمیک به فلودارابین را افزایش دهد. این یافته ها نشان می هد که نانوذرات اکسید آهن حامل های کارایی به منظور انتقال همزمان siRNA و دارو به سلول های لوسمیک هستند و درمان ترکیبی بر مبنای فلودارابین siRNA CD73 یک روش موثر در درمان CLL می باشد که بایستی مطالعات بیشتری بر روی آن انجام پذیرد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
