تعیین اثر مهار WEE1 با استفاده از siRNA بارگذاری شده روی نانوذره بعنوان عامل بهبود در پاسخ به شیمی درمانی های مبتنی بر آسیب DNA در لوسمی لنفوبلاستیک حاد.
Determining the effect of WEE1 inhibition using the siRNA loaded on Nanoparticle as an improvement agent in response to DNA Damage-Based Chemotherapies in Acute Lymphoblastic Leukemia.
مجریان: عباسعلی حسین پورفیضی , فرهاد جدیدی نیارق
خلاصه روش اجرا: جمعیت هدف مطالعه بر روی سل لاین های jurkat E6.1 که سلولهای سرطانی از نوع لنفوسیتT و از بیمار مبتلا بهALL و NALM6 که ازخون محیطی بیمار۱۹ ساله با ALL B-تایید شده است از بانک سلولی پاستور تهیه خواهند شد. همچنین نمونه های خون محیطی ۱۰ بیمار باALL تایید شده پس از کسب رضایت آگاهانه جمع آوری خواهد شد. همچنین اطلاعات بیشتری از برخی ویژگی های بیماران مثل ناهنجاریهای ژنتیکی راجعه ، رویکردهای درمانی قبل از عود و بازگشت بیماری مربوط به بیمارانand remission relapse ، جنسیت بیماران و...نیز برای ارزیابی های تکمیلی جمع آوری خواهد شد . نمونههای خون محیطی همچنین از اهدا کنندگان سالم به صورت موازی و منطبق به عنوان گروه کنترل دریافت خواهد شد. در این مطالعه داروهای شیمی درمانی سرطان رایج، SiRNA ، BV6 و نانو ذرات حامل به صورت SINGLE AGENT و COMBINATIONAL استفاده خواهد شد. این مطالعه دو فاز دارد: ۱.تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات حاوی siRNA : نانو ذرات تولیدی با واکنش کیتوزان و اسید لاکتیک باید نانوذرات کیتوزان لاکتات RNA مداخله گر را در بر بگیرند. و نانوذرات حاوی siRNA تولید می شوند که خصوصیات فیزیکو شیمیایی آن ها بررسی می شود. تولید کمپلکس نانوذرات-siRNA با ژل اکتروفورز در ژل 2% آگارز تایید می شود و میزان بارگیری siRNA به صورت کمی بوسیله روش اولتراسانتریفیوژ بررسی خواهد شد. ۲. مطالعه in vitro اثر بخشی نانو ذرات تهیه شده : از سل لاین های jurkat و NALM6 و سلولهای لوسمیک خون محیطی بیماران مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد در این مطالعه استفاده خواهد شد که این سلولها در محیط RPMI1640 حاوی fetal bovine serum 10% و آنتی بیوتیک کشت داده می شوند. پس از گذشت ۲۴ ساعت از کشت سلولی نانوذرات حاوی siRNA را به محیط کشت هر رده سلولی اضافه می کنیم. برای ارزیابی تکثیر سلولی، سلولها تحت داروهای مورد آزمایش تیمار می شوند و سپس پرولیفراسیون سلول ها توسط MTT تعیین می شود، اثرات افزایشی سینرژیستی و آنتاگونیستی دارو ها نسبت به هم توسط COMPUSYN SOFTWARE تعیین می شود .تیمار های دارویی در ۳ تکرار انجام می شود تا آزمایش به صورت مستقل و غیر وابسته انجام شده باشد. آنالیز فلوسیتومتری اپوپتوز با استفاده از PROPIDUM IODIDE (PI) /ANNEXIN V بر اساس دستور العمل سازنده انجام خواهد شد و درصد سلولهای ANNEXIN V /PI POSITIVE با ارزیابی حداقل ۱۰۰۰۰ سلول تعیین خواهد شد ،میانگین درصد سلولهای ANNEXIN V /PI POSITIVE و خطای استاندارد حداقل در دو آزمایش مستقل محاسبه خواهد شد. آنالیز چرخه سلولی با استفاده از رنگ آمیزی PI مخلوط (PI STAINING MIX ) انجام خواهد شد، برای ارزیابی تاثیر مهار WEE1 بر بیان ژن های اجزای مختلف چکپوینت G2-M از کیت های تجاری RTQ-PCR استفاده خواهد شد همچنین بررسی میزان بیان پروتئین های WEE1وgH2AXوp-CDK1به روش WESTERN BLOT ANALYSIS انجام خواهد شد .
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 64476 |
| عنوان فارسی طرح | تعیین اثر مهار WEE1 با استفاده از siRNA بارگذاری شده روی نانوذره بعنوان عامل بهبود در پاسخ به شیمی درمانی های مبتنی بر آسیب DNA در لوسمی لنفوبلاستیک حاد. |
| عنوان لاتین طرح | Determining the effect of WEE1 inhibition using the siRNA loaded on Nanoparticle as an improvement agent in response to DNA Damage-Based Chemotherapies in Acute Lymphoblastic Leukemia. |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | ایمونوتراپی بیماریهای شایع با استفاده از ژن درمانی |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | کارشناسی ارشد |
| مدت اجرا - ماه | 12 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | اگر چه پیشرفت های بسیاری در زمینه شناخت عوامل بیماریزایی ALL انجام شده و همچنین نتایج درمانی نیز بهبود قابل توجهی داشته است، با این وجود درصدی از بیماران پاسخ به درمان نامطلوبی دارند. به همین دلیل نیاز بالینی برای تشخیص اهداف درمانی جدید برای یافتن درمانهای با کارایی بالا و یا بهبود کارائی درمان های سنتی حاضر در درمان و افزایش نرخ بقا در بیماران ALL احساس میشود. همچنین مطالعات قبلی نشان دهنده ثمر بخش بودن کارائی درمان های ترکیبی جدید در همراهی با داروهای مبتنی بر آسیب به DNA بودهاند،اینگونه اثرات همیاری داروها در کاهش دوز های درمانی و به تبع آن کاهش سمیت ناشی از رویکردهای درمانی رایج نیز موثر میباشد.با وجود دیتا در مورد اثر بخشی چنین رویکردهای درمانی هنوز مطالعات کمی در خصوص بررسی مکانیسم های اثر بخشی و کارائی آنها در بدخیمی های خونی خصوصا ALL انجام شده است. به این ترتیب این مطالعه با نشان دادن مسیر مکانیسم عمل پیشنهادی , بر روی ارائه روشهای درمانی جدید بصورت Single target و یا با نشان دادن پیامدهای درمان های ترکیبی, بر روی پیشنهاد دادن اهداف با اثرات همیاری بصورت combination تمرکز دارد.این رویکرد ها به ما اجازه می دهند دوز سمیت داروهای شیمی درمانی را در حالی که اثر بخشی بالینی دارند، کاهش دهیم و از این طریق SAFETY و حساسیت سرطان ها با درمان های سنتی مرسوم را بهبود بخشیم. |
| اهداف اختصاصی | تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات حاوی siRNA -تعیین تاثیر مهار WEE1 در همراهی با داروهای شیمی درمانی رایج و BV6 بر روی بیان ژن های آپوپتوتیک و انتی اپوپتوتیک در لوسمی لنفوبلاستیک . -تعیین تاثیر مهار WEE1 در همراهی با داروهای شیمی درمانی سنتی و BV6 بر روی افزایش حساسیت به داروهای شیمی درمانی سنتی در لوسمی لنفوبلاستیک -تعیین تاثیر مهار WEE1 در همراهی با داروهای شیمی درمانی سنتی و BV6 بر روی تکثیر و سمیت سلولی در لوسمی لنفوبلاستیک حاد - |
| چکیده انگلیسی طرح | Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a type of cancer characterized by uncontrolled clonal proliferation of abnormal lymphoid progenitor cells in the bone marrow and blood, accompanied by the disruption of normal hematopoiesis and production of blood cells. The usual treatments for patients with acute lymphoblastic leukemia are chemotherapy regimens. Traditional chemotherapeutic agents are cytotoxic by means of interfering with cell division (mitosis).the majority of traditional anti-leukemia chemotherapeutic are DNA damaging agents, including antimetabolites, alkylating agents and topoisomerase inhibitors. but cancer cells vary widely in their susceptibility to these agents. To a large extent, chemotherapy can be thought of as a way to DNA damage or replication stress cells, which may then lead to cell death if apoptosis is initiated. however, resistance to these chemotherapeutic agents remains the primary cause of treatment failure. One mechanism of chemotherapy resistance is the increasing of DNA damage response (DDR). the expression of several DDR genes may be fundamental to sustain the genetic instability, to overcome the inhibitory signal of DNA damage checkpoint activation, and to promote proliferation. The WEE1 kinase is a key player in the DDR process and acts to inhibit mitotic entry in cells with damaged DNA. Wee1 encodes a nuclear protein measuring 96 KD, which is a tyrosine kinase belonging to the Ser/Thr family of protein kinases . It is markedly active during G2 phase of the cell cycle, and acts as a crucial regulator of the G2/M and DNA damage checkpoints . Cyclin-dependent kinase 1 (CDK1) and cyclin B comprise the maturation promoting factor, which initiates the process of mitosis . Wee1 phosphorylates the amino acids Tyr15 and Thr14 of CDK1, thus inactivating the CDK1-cyclinB complex, arresting cell cycle and preventing mitotic entry. Several studies speculated on the importance of WEE1 expression in cancer cells ascribing a dual biological role as a tumor suppressor, whose loss promotes the accumulation of genetic aberrations on pre-neoplastic lesions, or as a cancer-conserving oncogene, whose expression protects cancer cells from DNA damage and aberrant mitosis. Thus, suppression of WEE1 may have synergistic effects with DNA damaging agents in ALL cells.Therefore inhibition of the DDR is a promising therapeutic strategy to sensitize cancer cells to an additional therapeutic compound, with the goal to improve treatment response rates. Indeed, the bypass of the DNA damage checkpoint activation by pharmacological inhibition of WEE1 led to the increased DNA damage, and induced apoptosis in ALL cells. |
| کلمات کلیدی | : siRNA RNA مداخله گر (RNAi) اصطلاح کلی است که به تکنولوژی خاموشی پس از رونویسی توسط RNA دو رشته ای اطلاق گردیده و در گیاهان با اصطلاح PTGS عنوان می شود .در تکنولوژی RNA مداخله گر (RNAi) ، رشته مکمل mRNA ژن مورد نظر ساخته شده و این رشته به mRNA ژن هدف متصل و یک توالی دورشته ای (dsRNA) را بوجود می آورد. از آنجا که سیستم سنتز پروتئین قادر به ترجمه mRNA دو رشته ای نمی باشد، بیان ژن هدف متوقف و اصطلاحاً ژن خاموش می شود. کیتوزان : کیتوزان یک آمینو پلی ساکارید خطی و ترکیبی از پیوند های (۴→۱ β) واحدهای D-گلوکزآمین وN-استیل -D-گلوکزآمین است. کیتوزان توسط داستیلاسیون کیتین ( پلی ساکارید طبیعی و فراوان موجود در اسکلت خارجی سخت پوستانی همچون خرچنگ و میگو)، تهیه می شود. این پلی ساکارید کاتیونی به دلیل دسترس پذیری فراوان، چسبندگی بی نظیر، خواص دارویی مناسب و دیگرخواص سودمند بیولوژیکی مثل زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری، عدم سمیت و تحریک کم سیستم ایمنی، در موارد بیوپزشکی و دارویی مورد توجه گسترده قرارگرفته است. نانوذره (Nanoparticle) : ذراتی هستند که ابعاد آنها در حدود ۱ تا ۱۰۰ نانومتر است. لیپوزمها، درخت سانها، نانو ذرات پلیمری، نانو ذرات پوشش داده شده با پلیمرها، نانو ذرات کیتوزان و لستین و نانو ذرات دارویی نمونههایی از نانو ذراتی میباشند که برای دارو رسانی استفاده شده اند. WEE1 : یک کیناز هسته ای متعلق به خانواده سرین ترئونین پروتئین کیناز ها می باشد. وزن مولکولی ۹۶ کیلو دالتونی دارد و یک تنظیم کننده کلیدی در پیشرفت چرخه سلولی می باشد، با مهار ورود به میتوز در اندازه و شکل سلولی تاثیر گذار است . با مهار CDK1 عامل مهار آ غاز میتوز است. با مهار و تنظیم منفی MITOSIS PROMOTING FACTOR (MPF) عامل مقاومت به اپوپتوز در اثر آسیب بهDNA می باشد. : (CHECKPOINT KINASE 1)CHK1 سرین ترئونین پروتئین کیناز می باشد و در DNA DAMAGE RESPONSE (DDR) و CELL CYCLE CHECKPOINT RESPONSE مشارکت دارد ، که فعال شدن آن مهار چرخه سلولی و اصلاح آسیب در DNA و اپوپتوز را در پی دارد CHK1 علاوه بر اثرات در چکپوینت های چرخه سلولی ، همچنین در فرآیند اصلاح DNA و رونویسی ژن، توسعه رویانی ، پاسخ به عفونت HIV و پایداری سلول های سوماتیک نقش دارد. (CHECKPOINT KINASE 2)CHK2 : به عنوان تومور ساپرسور شناخته شده است و در اصلاح خطاهای DNA و توقف چرخه سلولی و اپوپتوز در پاسخ به آسیب در DNA عملکرد دارد ، و زمانی که DNA دچار شکست دو رشتهای می شود CHK2 فعال می شود و سپس CDC25 فسفاتاز را مهار می کند و CDC25 نیز که CDK را دفسفریله و فعال می کرد، مهار شده و CDK غیر فعال میماند . جهش در ژن کد کننده CHK2(CHEK2) عامل بسیاری از سرطان ها می باشد. (CYCLIN DEPENDENT KINASE 1)CDK1 : یک پروتئین محافظت شده است و جزو سرین ترئونین پروتئین کیناز ها می باشد فسفریلاسیون این پروتئین ها در صورتی که به CYCLIN مربوط متصل باشند عامل پیشرفت چرخه سلولی می باشد. در تنظیم عبور از مرحله ی G2-M چرخه سلولی نقش دارد CDK1 تمایل بیشتری به اتصال و همراهی با CYCLIN A,B دارد. CYCLIN DEPENDENT KINASE 2)CDK2 : جزء خانواده سرین ترئونین پروتئین کیناز ها می باشد و در تنظیم عبور از مرحله G1-S چرخه سلولی نقش دارد . CDK2 تمایل بیشتری به اتصال و همراهی با CYCLIN A,E دارد . CYCLIN : گروهی از پروتئین ها که کنترل کننده پیشرفت چرخه سلولی از طریق فسفریلاسیون و فعال کردن آنزیمهای CDK می باشند. سایکلین ها هنگامی که به کیناز مربوطه متصل شوند عامل تشکیل MPF میشوند و MPF نیز دیگر پروتئین ها را از طریق فسفریلاسیون فعال می کند ، که این پروتئین ها مسئول اتفاقات چرخه سلولی مثل شکل گیری میکروتوبول ها و ویرایش کروماتین می باشند. |
| ذینفعان نتایج طرح | درمان سرطان به دلیل قرار گرفتین سرطان در زمره بیماری هایی که هزینه فراوانی را برای جامعه و بیماران به دنبال داشته و سالانه باعث خروج مقادیر فراوان ارز کشور برای تهیه درمان سرطان می شود. بنابراین پیدا کردن روشی برای درمان این بیماری می تواند منافع بسیاری برای بیماران، جامعه داشته نقش به سزایی در حفظ تمامیت عرضی دارد. |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| عباسعلی حسین پورفیضی | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| فرهاد جدیدی نیارق | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| سعید سلالی | مشاور |
| مهدی یوسفی | مشاور |
| سجاد وکیلی | دانشجوی مالک پایان نامه |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر مهار سرین ترئونین کیناز WEE1 موجب افزایش حساسیت سلول های لوسمیک نسبت به دوکسوروبیسین می شود.متن خبر مقابله با مقاومت دارویی چالش اصلی در درمان لوسمی لنفوبلاستیک حاد، ALL، می باشد. WEE1 سرین/ ترئونین کیناز به عنوان عامل اصلی تحریک فعال شدن مسیرهای DDR در سلولهای لوسمیک در اثر درمان با داروهای شیمی درمانی مبتنی بر ایجاد آسیب در DNA مثل دوکسوروبیسین مطرح می باشد. بنابراین مهار کارآمد WEE1 هدفی منطقی برای رفع مقاومت دارویی در لوسمی لنفوبلاستیک حاد می باشد. در این مطالعه برای اولین بار نانوذرات به عنوان سیستم انتقالی دکسوروبیسین و siRNA برای مهار WEE1 وغلبه بر مقاومت دارویی استفاده شد. دکسوروبیسین و WEE1 siRNA حمل شده با نانوذرات باعث کاهش شدید بیان WEE1 و افزایش آسیب در ژنوم شدند که منجر به رفع مقاومت ناشی از دوکسوروبیسین در سلولهای مشتق از بیماران و رده های سلولی ALL گردید. ترکیب NPs-WEE1 siRNA- Doxorubicin اثرات سینرژیکی نسبت به هم نشان دادند و باعث افزایش چشمگیر مرگ سلولی ناشی از فعال شدن مسیر های آپوپتوز شدند. نتایج این مطالعه نشان می دهد که ترکیب دوکسوروبیسین و مهار WEE1 با استفاده از siRNA حمل شده با نانوذرات می تواند به عنوان روش نوید بخش در مقاومت دارویی محسوب گردد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
