تاثیر سلولهای بنیادی مزانشیمال در درمان مدل تجربی مثانه نوروژنیک

مجریان: سکینه حاج ابراهیمی

خلاصه روش اجرا: تمام فرآیندهای این پژوهش مطابق با آئین نامه کمیته اخلاقی و موسسه ملی استفاده اخلاقی ازحیوانات آزمایشگاهی انجام خواهد شد و تمام قوانین مربوط به بیانیه هلسینکی در مورد استفاده و مراقبت از حیوانات در طول تمام مراحل رعایت خواهد شد (101). در پژوهش حاضر رتهای ویستار ماده بالغ با وزن 250-300 گرم (13 هفته) استفاده خواهند شد. رت¬ها در محیط با دمای کنترل شده (23 درجه سانتی¬گراد و 50% رطوبت) و نور مناسب و غذا و آب در دسترس و با سیکل 12 ساعت روشنایی/تاریکی نگه داری می¬شوند. به منظور عادت کردن حیوانات به شرایط آزمایشگاهی، 3 روز قبل از جراحی حیوانات به اتاق جراحی (در مرکز تحقیقات علوم اعصاب) منتقل خواهند شد تا به محیط آزمایشگاه عادت کنند. در طول این مدت آب و غذا بدون محدودیت در اختیار حیوان¬ها قرار خواهد گرفت. قبل از درمان برای جلوگیری از آسیب های ناخواسته و در اصطلاح آسیب¬های غیر جراحی دوره ریکاوری، هر حیوان به صورت انفرادی، در یک قفس با پوشال ضخیم نگهداری خواهد شد، پلت حیوان خیسانده خواهد شد و در قفس ریخته خواهد شد تا حیوان برای خوردن آن متحمل حرکتی اضافی نکرده و دچار آسیب احتمالی نشود. برای دادن آب نیز از بطری¬های دارای نازل طویل استفاده می¬شود تا حرکت حیوان برای نوشیدن آب را کمتر کند. قفس حیوان هر 3 روز یکبار تعویض و بعد از شستشو با الکل 70 درجه ضدعفونی می شود تا احتمال وقوع عفونت به حداقل رسانده شود. دستکاری حیوانات توسط فرد ماهر انجام خواهد شد و در ضمن بعد از عمل همه حیوانات درمانهای حمایتی را به ترتیبی که در پروپوزال آورده شده است دریافت خواهد کرد. در مرحله درمان نیز فرآیندهای نگهداری به همین منوال خواهد بود، مضافا بر اینکه در صورت رخداد هرگونه عفونت یا عارضه اضافی بر فرآیند استاندارد، حیوان حذف خواهد شد. رت¬ها به طور تصادفی به چهار گروه (10 عدد در هر گروه)، به شرح زیر تقسیم خواهند شد: گروه1: گروه کنترل که هیچ مداخله ای را دریافت نخواهند کرد. گروه 2: sham-operation: که فقط تحت جراحی لامینکتومی قرار می¬گیرند و نرمال سالین در عضله مثانه تزریق خواهد شد. گروه 3: آسیب عصبی نخاعی القا شده (SCI): بعد از ایجاد آسیب نخاعی، نرمال سالین در عضله مثانه تزریق خواهد شد. گروه 4: SCI دریافت کننده سلول¬های بنیادی مزانشیمال انسانی: سلولهای نشاندار شده مزانشیمال توسط dil، 4 هفته بعد از ایجاد آسیب نخاعی در 6 ناحیه در عضله مثانه و به تعداد 106*2 سلول تزریق و مثانه 4 هفته بعد از تزریق سلولهای مزانشیمال جهت بررسی بافت شناسی خارج خواهد شد. سلول¬های بنیادی مزانشیمی انسانی مشتق از مغز استخوان رت: سلولهای بنیادی مشتق از مغز استخوان (فمور و تیبیا) رت¬های ویستار با سن 13 هفته و وزن 250-300 گرم گرفته خواهند شد. ابتدا تکه¬های بافتی با محلول 1-0.1% کلاژناز و 0.25% تریپسین به نسبت 50-50 بر روی تکه¬های بافتی اضافه و در دمای 37 درجه به مدت 3-1 ساعت انکوبه می¬گردد. بعد از این زمان محلول آنزیمی کدر شده برای خنثی کردن اثر تریپسین و کلاژناز محیط کشت حاوی 10% FBS اضافه می¬گردد. محلول رویی حاوی سلول جمع¬آوری شده و با دور rpm 2000 -1000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ می¬گردد. سپس pellete سلولی تشکیل شده 2 بار با PBS شستشو داده شده و سلولها به تعداد 104*1 سلول در هر میلی¬لیتر (cm2) از کف فلاسک T-25 کشت داده می¬شوند. محیط کشت استفاده شده جهت این کار low glucose DMEM حاوی 2-1%penstrep و 10% FBS می¬باشد. محیط کشت هر 4 روز یک بار تعویض می¬شود. سلولهای کشت شده در سومین پاساژ استفاده خواهند شد (102, 103). نشاندار کردن سلول¬های بنیادی مزانشیمال: به منظور track یا ردیابی سلولها بعد از انجام تزریق، سلولها با رنگ حیاتی dil307 رنگ¬آمیزی می¬شوند. به این منظور تعداد سلولهای مورد نظر برای تزریق، با غلظت µmol20 از این ماده به مدت 30-20 دقیقه انکوبه می¬گردند. بعد از زمان انکوباسیون سلولها با PBS شستشو داده شده و به تعداد 106*2 سلول به محل مورد نظر تزریق می¬شوند (102). القای آسیب نخاعی: جهت القای آسیب نخاعی بر اساس مطالعات قبل به روش Weight Drop می¬باشد (104). به اینصورت که ابتدا رت¬ها با استفاده از مخلوطی از کتامین و زایلازین ( به ترتیب 80 و 8 میلی¬گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) بیهوش شده و به منظور جلوگیری از خشکی قرنیه یک قطره Mineral Oil (روغن معدنی) درهر کدام ازچشمها ریخته می¬شود. بعد از رسیدن به بی¬هوشی عمیق، موهای ناحیه مورد نظر تراشیده شده و سپس با مخلوطی از بتادین 10 درصد و الکل 70 درجه کاملا ضدعفونی خواهد شد. سپس در ادامه یک برش در این ناحیه انجام خواهد شد و بعد از کنار زدن پوست و لایه های زیر جلدی، با کند کاری به موقعیت مهره مورد نظر (در سطح مهره¬های T9-T8) (26, 71, 80, 96-99) دسترسی پیدا خواهد شد. در ادامه با استفاده از فرز کوارتزی متصل به میکروموتور دندانپزشکی قسمت پشتی مهره تا رسیدن به نخاع به آرامی برداشته خواهد شد. با نمایان شدن نخاع یک میله با سطح مقطع 2 میلیمتر و به وزن 15 گرم از ارتفاع 5 سانتیمتری عمود بر ناحیه لامینکتومی شده رها شده تا ضایعه نخاعی در سطح T9 ایجاد شود (105). بعد از ایجاد آسیب، لایه¬های پوست، زیرجلد و عضله با استفاده از بخیه ترمیم خواهند شد. تمام حیوانات تزریق داخل صفاقی سیپروفلوکساسین به مدت 3 روز و نرمال سالین (3 میلی¬لیتر) بعد از جراحی دریافت خواهند کرد. همچنین حیوانات تجویز خوراکی شربت استامینوفن10میلی¬گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن جهت کاهش دردهای نوروپاتیک و بعد از عمل جراحی به مدت 3 روز دریافت خواهند کرد. تخلیه مثانه از طریق فشار دادن آن دوبار در روز صورت خواهد گرفت و تا زمانی که مقدار ادرار خارج شده کمتر از 0.5 میلی¬لیتر در روز باشد، ادامه خواهد یافت (80). تست¬های رفتاری لکوموتور: تستهای رفتاری با استفاده از ابزار Basso-Beattie-Bresnaham (BBB) ارزیابی خواهند شد. این تست به منظور ارزیابی بهبود حرکتی اندام تحتانی مدل¬های رت دارای ضایعه نخاعی انجام می¬گیرد. محدوده نمرات آزمون BBB از صفر در فقدان حرکت تا 21 با حرکت طبیعی متغیر است. برای انجام این تست، ابتدا هر رت به طور جداگانه در داخل میدان باز (open field) قرار گرفته و توسط دو ارزیاب که از نظر گروههای تحت بررسی Blind هستند و هر دو سمت رت¬ها را از نظر راه رفتن در عرض 4 دقیقه در یک فضای باز (جعبه استوانه¬ای شکل) به قطر 90 میلی¬متر و ارتفاع 15 سانتی¬متر با کف صاف بررسی خواهد شد. (106). نمرات داده شده آنالیز آماری خواهند شد. لازم به ذکر است سیستم نمره¬دهی مورد نظر با توجه به توضیحات زیر خواهد بود: 0-بدون حرکت قابل مشاهده در اندام تحتانی 1-حرکت محدود و جزئی در یک یا دو مفصل معمولا در مفصل زانو و ران. 2-حرکت وسیع در یک مفصل یا حرکت وسیع در یک مفصل و حرکت جزئی در مفصل دیگر. 3- حرکت وسیع در دو مفصل. 4- حرکت جزئی در هر سه مفصل اندام تحتانی. 5- حرکت جزئی در دو مفصل و حرکت وسیع مفصل سوم. 6- حرکت وسیع در دو مفصل و حرکت جزئی در مفصل سوم. 7- حرکت وسیع در هر سه مفصل اندام تحتانی. 8-خزیدن بدون تحمل وزن. 9-ستون کردن دست و پا با تحمل وزن تنها در محدوده ثابت یا بطور موقت یا قدم زنی با پشت پا. 10-قدم زنی با تحمل وزن موقتی و بدون هماهنگی اندام تحتانی و فوقانی. 11- قدم زنی با تحمل وزن ثابت و هماهنگی موقتی اندام تحتانی و فوقانی. 12- قدم زنی با تحمل وزن ثابت و هماهنگی موقتی اندام تحتانی و فوقانی. 13- قدم زنی با تحمل وزن ثابت و هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی. 14- قدم زنی با کنترل وزن کامل، هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی. وعمدتا با چرخش پنجه پا (به خارج و یا داخل) در طول حرکت در راستای بدن 15- قدم زنی ثابت، هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی بدون حرکت انگشت پا یا حرکت اتفاقی انگشت پا درطول بدن، عمدتا موقعیت پنجه پا موازی بدن بهنگام تماس اولیه است. 16- قدم زنی ثابت، هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی وحرکت انگشت پا متناوبا در حرکت رو به جلو پا رخ می¬دهد، عمدتا موقعیت پنجه پا موازی بدن بهنگام تماس اولیه و خمیده بهنگام حرکت است. 17- قدم زنی ثابت، هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی وحرکت انگشت پا متناوبا در حرکت رو به جلو پا رخ می¬دهد، عمدتا موقعیت پنجه پا موازی بدن بهنگام تماس اولیه و بهنگام حرکت است. 18- قدم زنی ثابت، هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی وحرکت انگشت پا دائما در حرکت رو به جلو پا رخ می¬دهد، عمدتا موقعیت پنجه پا موازی بدن بهنگام تماس اولیه و خمیده بهنگام حرکت است. 19- قدم زنی ثابت، هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی وحرکت انگشت پا دائما در حرکت رو به جلو پا رخ می¬دهد، عمدتا موقعیت پنجه پا موازی بدن بهنگام تماس اولیه و بهنگام حرکت است ودم حیوان اغلب رو به پائین است. 20- قدم زنی ثابت، هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی وحرکت انگشت پا دائما در حرکت رو به جلو پا رخ می¬دهد، عمدتا موقعیت پنجه پا موازی بدن بهنگام تماس اولیه و بهنگام حرکت است و حیوان دم را بطور ثابتی بالا برده و تنه را نگه میدارد. 21- قدم زنی ثابت، هماهنگی ثابت اندام تحتانی و فوقانی وحرکت انگشت پا دائما در حرکت رو به جلو پا رخ می¬دهد، عمدتا موقعیت پنجه پا موازی بدن بهنگام تماس اولیه و بهنگام حرکت است وپایداری کامل تنه و بالا نگه داشتن ثابت دم مشهود است نمرات 7-0 نشان دهنده برگشت عضلات فلج شده در مفصل، زانو و لگن می¬باشد. نمره 13-8 نشان دهنده برگشت حرکت و هماهنگی پنجه ها به همراه forelimbs است. نمره21-14 نشان دهنده برگشت فاصله انگشت در طول راه رفتن، تسلط به نگهداشتن وضعیت انگشتان، پایداری در بالاتنه و وضعیت دم می¬باشد. استفاده از ضبط تصاویر ویدیویی برای ارزیابی و مقایسه بین گروهها مفید است (104, 107). عملکرد لکوموتور هر گروه هر 7 روز تا زمان کشته شدن ارزیابی خواهد شد. آزمایش 1 هفته پس از ایجاد آسیب در گروههای مداخله شروع و تا 8 هفته بعد ادامه خواهد یافت. سیستومتری: پاسخ ادراری 4 هفته بعد از تزریق MSCs بررسی خواهد شد. رت¬ها با استفاده از مخلوطی از کتامین و زایلازین ( به ترتیب 80 و 8 میلی¬گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) برای وارد کردن کاتتر پلی¬اتیلنی با لومن دوگانه به مثانه (کاتتر (PE-50)) بیهوش شده و مثانه از طریق برش شکمی میدلاین در معرض دید قرار خواهد گرفت. سر کاتتر از طریق برش خیلی کوچک در ناحیه dome مثانه وارد مثانه شده و با بخیه تثبیت خواهد شد. سر دیگر کاتتر از طریق بافت زیرجلدی عبور و از طریق پوست به بیرون راه می¬یابد. پس از بستن برش شکمی توسط بخیه زدن عضله و پوست، رت¬ها به مدت 5-6 ساعت (شامل 2 ساعت جهت ریکاوری به دنبال بیهوشی) در قفسی که به اندازه کافی به آنها وضعیت خزیدن (crouching) را اجازه داده ولی جهت چرخش به اطراف تنگ است قرار داده می¬شوند. در دستگاه یورودینامیک ساخته شده توسط دانشگاه علوم پزشکی تبریز جهت بررسی عملکرد مثانه در رت، یک لومن کاتتر مثانه به ترانسدیوسر فشار وصل شده و توسط پلی¬گراف ثبت می¬شود و لومن دیگر به یک سرنگ پر شده از نرمال¬سالین به پمپ انفوزیون متصل می¬گردد. همچنین یک pan سنسوردار جهت اندازه¬گیری حجم ادرار باقیمانده و دفع شده، در زیر محفظه نگهداری رت¬ها قرار داده می¬شود. سالین فیزیولوژیک در دمای اتاق و با سرعت 10میلی¬لیتر در ساعت در ابتدا و سپس تعدیل سرعت به 5 میلی¬لیتر در ساعت برای ایجاد پاسخ ادراری تکرار شونده انفوزیه خواهد شد و هر 30 دقیقه برای برقراری سیکل ادرار کردن متوقف می¬شود (108). اغلب ادرار باقیمانده در حین وارد کردن کاتتر خارج و مقدار کمی از آن در حین شروع یورودینامیک خارج خواهد شد. تزریق سالین در جریان ادرار متوقف خواهد شد. سالین دفع شده از مئاتوس اورترا برای تعیین حجم ادرار اندازه¬گیری می¬شود و سپس PVR محاسبه می¬شود. سالین باقیمانده ابتدا از طریق کاتتر داخل مثانه کشیده شده و سپس مثانه با فشار دستی بر روی دیواره شکم برای جمع کردن محتویات باقیمانده داخل مثانه، تخلیه می¬شود (80, 108). در طول یورودینامیک موارد ذیل ارزیابی خواهند شد: - فشار داخل مثانه برای القای ادرار: توسط سیستومتروگراف و بصورت mmHg ثبت می¬شود. - Pressure threshold: توسط سیستومتروگراف و بصورت mmHg ثبت می¬شود و شامل فشار داخل مثانه¬ای است که بلافاصله قبل از ادرار کردن ایجاد می¬شود (104). - حداکثر فشار ادرار(cmH2O) Maximal bladder pressure at voiding: توسط سیستومتروگراف ثبت می¬شود و شامل بیشترین فشار در طول ادرار کردن می¬باشد (109). - Inter-contraction interval (ICI: فاصله بین ادرار یا رفلکس انقباضات مثانه): توسط سیستومتروگراف ثبت می-شود. - Voiding pressure: توسط سیستومتروگراف و بصورت mmHg ثبت می¬شود. - فرکانس (time/minute) یا Voiding frequency : هر 30 دقیقه و به مدت 150 دقیقه مشاهده خواهد شد. - Gross bladder pattern in filling phase شامل نرمال، هیپررفلکسی (فرکانس زیاد انقباضات دترسور نسبت به میانگین کنترل +2 انحراف معیار) وflaccid (عدم وجود انقباضات قابل رویت دترسور) Gross pattern of voiding (%) (Flaccid, overactive, Normal) - فشار پایه (Basal pressure): پایین¬ترین فشار مثانه در طول فاز filling که توسط سیستومتروگراف ثبت می¬شود (110). - فشار ادرار، حجم ادرار (Voided volume) و حجم باقیمانده ادرار پس از دفع: ادرار باقیمانده در حین وارد کردن کاتتر خارج و مقدار کمی از آن در حین شروع یورودینامیک خارج خواهد شد. تزریق سالین در جریان ادرار متوقف خواهد شد. سالین دفع شده از مئاتوس اورترا برای تعیین حجم ادرار اندازه¬گیری می¬شود و سپس PVR محاسبه می¬شود. که شامل مقدار ادرار باقیمانده بعد از ادرار کردن می¬باشد (109, 110). - ظرفیت مثانه: از طریق جمع کردن حجم ادرار دفع شده و حجم PVR محاسبه می¬گردد (110). - کمپلیانس مثانه: بر اساس معیارهای یورودینامیک از تقسیم تغییرات حجم بر تغییرات فشار دترسور در طول تغییرات حجم مثانه بدست می¬آید (17). - non-voiding Detrusor contraction during filling phase : با شمارش تعداد انقباضات مثانه در طول فاز پر شدن مثانه توسط سیستومتروگراف بدست می¬آید. - :Bladder volume (mm) قطر dome مثانه برای ارزیابی غیر مستقیم حجم مثانه اندازه¬گیری خواهد شد. حجم مثانه بصورت زیر محاسبه خواهد شد (108): Bladder volume = (Diameter of bladder dome / 2)3 ×ಗ × 4 / 3. - فشار داخل مثانه برای القای ادرار intravesical pressure to induce micturition: توسط سیستومتروگراف ثبت می¬شود. بررسی بافت شناسی مثانه و طناب نخاعی رت: بعد از انجام بررسی¬ها بر روی رت زنده، برای هر حیوان تزریق سالین سرد و پارافرمالدئید 4 درصد در PBS صورت خواهد گرفت. پس از 24 ساعت از فیکس شدن در پارافرمالدئید 4 درصد بافتهای طناب نخاعی و مثانه در پارافین قرار خواهند گرفت. برش¬های 4 میکرومتری بر روی بافت¬ها برای رنگ¬آمیزی با Masson’s trichrome ایجاد خواهد شد. نتایج جهت ارزیابی به پاتولوژی ارجاع خواهند شد. برای ارزیابی نتایج رنگ¬آمیزی با Masson’s trichrome بخشهای نماینده هر اسلاید به صورت blind با میکرومتر مربع مورد بررسی قرار گرفته و میانگین این نواحی از رنگ آمیزی به عنوان یک درصد نسبی بیان می¬شود. میانگین درصد نواحی کلاژن با توجه به فرمول (کلاژن + عضله) / (کلاژن) تعریف خواهد شد. این نواحی به عنوان عضله صاف که به رنگ قرمز و بافت همبند است که با رنگ آبی مشخص می¬شود (71). برش¬های بافتی 4 میکرومتری از قسمتهایی از طناب نخاعی آسیب دیده توسط تیونین 0.2% (Nissl) رنگ¬آمیزی و برای ارزیابی تغییرات مورفولوژیکی در نورونهای طناب نخاعی از این رنگ¬آمیزی استفاده خواهد شد. برش¬های طناب نخاعی توسط xylene دپارافینیزه شده و در محلول الکلی رهیدارته می¬شوند و به مدت 20 دقیقه در محلول تیونین 0.2% غوطه¬ور شده و در نهایت توسط الکل به دنبال تمیز کردن با xylene دهیدراته خواهند شد (71). ایمنوفلوروسنت برای ارزیابی تمایز سلولهای MSCs تزریق شده: بافت¬ها در پارافین جاسازی شده برش¬های (ضخامت 4 میکرومتری) ایجاد و روی اسلاید شیشه¬ای تثبیت می¬شوند. برش¬ها در xylene دپارافینیزه شده و در یک سری از محلول¬های الکلی، به دنبال dH2O رهیدراته می¬شوند (111). بافتها با توجه به ماندگاری رنگ حیاتی dil307 تا 120 روز بعد از نشاندار کردن سلولهای بنیادی، از نظر وجود این سلولها زیر میکروسکوپ فلوروسنت بررسی خواهند شد (102). در مثانه جایگزین شده توسط سلولهای بنیادی، سلولهای مزانشیمال ایمنوراکتیویته بر علیه smooth muscle actin بیان می¬کنند که نشاندهنده تمایز این سلولها به سلولهای عضله صاف مثانه خواهد بود (71). به این منظور از آنتی¬بادیهای اختصاصی smooth muscle actin به نسبت (1:1,000) استفاده خواهد شد. برشهای بافتی در آنتی¬بادیهای اختصاصی اولیه به مدت 1 شب در دمای 4 درجه سانتی¬گراد انکوبه می¬شوند. برشهای بافتی 3 بار با محلول Trisbuffered saline-Tween شستشو داده شده و در آنتی¬بادیهای اختصاصی انکوبه می¬شوند و زیر میکروسکوپ فلوروسنت بررسی می¬شوند. ارزیابی تغییرات کلاژن بافتی بعد از تزریق سلولهای MSCs: در گروه SCI و گروه SCI دریافت کننده سلولهای MSCs، میزان تغییرات کلاژن بافت مثانه ارزیابی و مورد مقایسه با گروه sham و کنترل قرار خواهد گرفت (71).