ارزیابی تاثیر لیپوزومال وریکونازول بر رشد، بیوسنتز ارگوسترول و میزان بیان ژنهای ERG11،Cdr1p و Cdr2p در ایزولههای کاندیدا آلبیکنس مقاوم به فلوکونازول با استفاده از تکنیک Real-time PCR
Evaluation of the Effect of liposomal voriconazole on growth, ergosterol biosynthesis and ERG11, CDR1p and CDR2p genes expression of fluconazole resistant Candida albicans using Real-time PCR technique.
مجریان: صنم نامی , لیلی عاقبتی
خلاصه روش اجرا: در قدم اول کاندیدا آلبیکنسهای مقاوم به فلکونازول جدا شده از بیماران ایرانی که تعیین هویت و حساسیت گشته استفاده میشود و یک سوش استاندارد از بانک زیستی قارچهای بیماریزای ایران به عنوان کنترل (کاندیدا آلبیکنس مقاوم به فلوکونازول به شماره 1267-97)خریداری شد. جهت بدست آوردن کلنی های تازه برای تهیه سوسپانسیون، کونیدیهای مورد تلقیح از آب مقطر به روی محیط پوتیتو دکستروز آگار منتقل میشوند. سپس برای تعیین MIC هر یک از ایزولههای فوق نسبت به داروی وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول به طریق in vitro و با استفاده از روش Broth microdilution و بر اساس استاندارد CLSI M27-A3 به ترتیب زیر انجام میگیرد: الف- تهیه محلول استوک از داروی وریکونازول در DMSO(µg/ml1600) تهیه محلول استوک لیپوزومال وریکونازول: فرمولاسیون¬های نانولیپوزوم¬ها با استفاده از روش ترکیبی هیدراسیون لایة نازک- سونیکاسیون، با کمی تغییرات تولید میگردد. ابتدا لستین،کلسترول و داروی وریکونازول در غلظت مشخص در حلال حل گردیده و سپس حلال در اواپراتور روتاری تبخیر شده و لایه نازک در ته فلاسک ته گرد تشگیل میگردد. بعد با استفاده از 10 سی سی آب مقطر استریل یا بافر PBS عمل هیدراسیون لایه نازک انجام میگردد. در این مرحله لیپوزومهای مولتی لاملار تشکیل می شوند. جهت کاهش اندازۀ لیپوزوم¬ها مراحل زیر انجام میگردد. ابتدا هموژنیزاتور کردن نمونه¬ها در هموژنایزر (با سرعت rpm 20000 در دمای بالای انتقال فاز لیپوزوم¬ها به مدت 15 دقیقه) و در ادامه انتقال مخلوط لیپوزومی به داخل حمام یخ و سونیکاتور پروب و اعمال 10 سیکل 1 دقیقه¬ای با 1 دقیقه استراحت ما بین سیکل¬ها بوده؛ در این مرحله نانو لیپوزوم¬های یونی لاملار تولید میشود. ب- تهیه رقت های سریال (µg/ml 16-8-4-2-1-5/0-25/0-125/0-625/0-0313/0) از داروهای فوق و ریختن آنها به میکروپلیت های 96 خانه ج- تهیه سوسپانسیون قارچی با غلظت 5 × 104 CFU/ml-0.4 × 104 د- اضافه کردن سوسپانسیون به هر یک از چاهکهای حاوی رقتهای داروئی و نگهداری در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 48-24 ساعت ه- خواندن نتایج به کمک آئینه و مقایسه با چاهکهای کنترل مثبت و منفی و- تعیین MIC توجه : در بررسی تست حساسیت دارویی از استرین های کاندیدا پاراپسیلوزیس) (ATCC22019 یا کاندیدا کروزئی ( ATCC6258) جهت کنترل کیفی استفاده میشود. برای مقایسه این روش از تکنیک Real-time PCR استفاده میکنیم. بدین منظور ابتدا با توجه به حداقل غلظت مهاری MIC50 وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول، قارچ مورد نظر را در محیط کشت PDA آگار کشت داده بعد انکوباسیون در دمای 30 درجه بمدت 48 ساعت رسوب را جدا کرده و RNA قارچ را با استفاده از کیت مربوطه استخراج میکنیم. به منظور مشاهده باندهای 28s،18s،5s الکتروفورز کرده و با اندازه گیری OD با نانودراپ میزان کمی وکیفی ارزیابی قرار میگیرد و در مرحله بعد cDNA سنتز می کنیم. برای طراحی و سنتز پرایمر با استفاده ازGenBank که بانک بین المللی ژن در NCBIاست و با استفاده از BLAST، شباهت ها پردازش شده و در نهایت با توجه به شرایط مورد نظربرای طراحی پرایمرها، پرایمرهای مربوط به ژنهای ERG11، Cdr1pوCdr2p ، طراحی میشود. پرایمرها با توجه به سکانس نوکلئوتیدی ژن و β Actin بعنوان( House Keeping gene) در کاندیدا آلبیکنس طراحی میشود و سپس جهت ساخت به شرکت مربوطه سفارش داده می شود. جهت کمیت سنجی نسبی، میزان بیان ژن مورد مطالعه (برطبق روش CT ∆∆) در قارچ مجاور شده با غلظت MIC50مشخص وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول و نمونه مجاور نشده درمقایسه بامیزان میانگینCt ژن هدف ERG11، Cdr1pوCdr2p و ژن مرجع اکتین (کالیبراتور) بر اساس فرمولهای ذیل محاسبه خواهد شد. فرمول 1 (ژن بتا- اکتین) CT- ( ژن ERG11، Cdr1pوCdr2p ) CT = (نمونه تیمار شده) ΔCT فرمول 2 (ژن بتا-اکتین) CT-(ژن ERG11، Cdr1pوCdr2p ) CT= (نمونه تیمارنشده) ΔCT فرمول 3 (نمونه تیمارنشده ) ΔCT - (نمونه تیمار شده ) ΔCT = ΔΔCT در پایان مقدار نرمال شده بیان ژن هدف از فرمول زیر محاسبه می گردد : فرمول 4 بیان نرمال شده ژن تمام تست ها حداقل با 3 بار تکرار (triplicate) انجام خواهد گرفت. نهایتا با استفاده از نرم افزار Excel نمودارها رسم و جهت مقایسه بیان ژنها قبل و بعد درگیری با دارو از تست Mann–Whitney U test / Wilcoxon استفاده خواهد شد. برای بررسی میزان ارگوسترول در کاندیدا آلبیکنس مورد بررسی تیمار شده با غلظت 50 MIC لیپوزوم وریکونازول ، 50MIC داروی وریکونازول و همچنین نمونه¬ تیمار نشده( کنترل )، 200 میلیگرم از نمونه در محلول 25% KOH(حاوی 25 میلی گرم از هیدروکسید پتاسیم حل شده در 35 میلیلیتر آب مقطر که حجم نهایی آن با اتانول به 100 میلیلیتر میرسد) به یک لوله درپوش دار انتقال داده میشود و به مدت 1 دقیقه ورتکس میشود. سوسپانسیون به مدت 5 ساعت در دمای بین 80 تا 100 درجه سانتی گراد انکوبه شده و سپس لوله حاوی سوسپانسیون خنک شده و 1 میلی لیتر از آب مقطر و 5 میلی لیتر از n-هپتان اضافه و سوسپانسیون حاصله مجددا به مدت 3 دقیقه به شدت ورتکس میشود. سپس تیوب¬ها در حالت سکون نگه داشته تا لایه آلی بصورت مجزا تشکیل شده که به یک لوله درپوش دار تمیز دیگر انتقال مییابند. تمامی تستها به صورت سه تایی انجام خواهد گرفت. با استفاده از اسپکتروفوتومتر، جذب نوری در طول موج 281 و230 نانومتر خوانده و نیز طیف مربوط به این فاز در طول موج 200-300 نانومتر اندازه گیری میشود[8]. محاسبه کمی به صورت زیر انجام خواهد شد: % ergosterol + % 24 (28) DHE = [ (Abs281.5/ 290) XF] / وزن پلیت … (A) % 24 (28) DHE = [(Abs230 / 518) X F] / وزن پلیت … (B) % ergosterol = A-B در این معادله، F فاکتور رقیقسازی است.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 63919 |
| عنوان فارسی طرح | ارزیابی تاثیر لیپوزومال وریکونازول بر رشد، بیوسنتز ارگوسترول و میزان بیان ژنهای ERG11،Cdr1p و Cdr2p در ایزولههای کاندیدا آلبیکنس مقاوم به فلوکونازول با استفاده از تکنیک Real-time PCR |
| عنوان لاتین طرح | Evaluation of the Effect of liposomal voriconazole on growth, ergosterol biosynthesis and ERG11, CDR1p and CDR2p genes expression of fluconazole resistant Candida albicans using Real-time PCR technique. |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | نانوفیبرها، نانوذرات و اسکافولدها (در طب بازساختی، مهندسی بافت و دارورسانی) |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | دکتری عمومی |
| مدت اجرا - ماه | 18 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | کاندیدا آلبیکنس عامل اتیولوژیک اغلب کاندیدیازیس مهاجم در افراد با زمینه مستعد و نیز افراد سالم به ویژه در ایران میباشد که موارد گزارش آن در کشور رو به افزایش بوده که توسط یافتههای هیستوپاتولوژیک نیز به اثبات رسیده است. از طرف دیگر با توجه به این که در تحقیقات انجام گرفته بر روی حساسیت دارویی ایزولههای کاندیدا آلبیکنس جدا شده از بیماران، بعضی از ایزولهها مقاوم به فلوکونازول وحتی وریکونازول شناخته شدند و با توجه به اینکه اخیرا اطلاعات مربوط به تعدادی از ژنهای مسئول در این مقاومت شناسایی شدهاند، لذا در این طرح برآن هستیم که با استفاده تاثیر لیپوزوم-وریکونازول بر رشد و بیان ژنهای ERG11، Cdr1pوCdr2p در ایزولههای کاندیدا آلبیکنس مقاوم به داروی فلوکونازول، بتوانیم راهکاری برای کنترل عفونت های قارچی در آینده ارائه طریق نمائیم. |
| اهداف اختصاصی |
|
| چکیده انگلیسی طرح | Although voriconazole is a newly developed antifungal agent, the side effects of this drug as well as the observation of drug resistance in some isolates has led to solutions for optimizing this drug. One such solution is the use of a drug delivery system that has overcome some problems associated with the use of this drug. In studies conducted on diverse drug delivery systems, the use of nanoparticles, as one of these systems, has shown an enhancement in therapeutic efficacy in addition to reducing side effects. This study is an attempt to investigate the effect of nano-liposome containing voriconazole on candida albicans strains on the one hand, and to consider the expression of ERG11, CDR1 and CDR2 genes, regarded as important genes involved in the development of resistance to triazoles before and after voriconazole and voriconazole-loaded nano-liposomes exert their effects, on the other hand. |
| کلمات کلیدی | کاندیدا آلبیکنس (Candida albicans) : یک قارچ مخمری است و معمولاً عامل ایجاد عفونتهای کاندیدیازیس است. وریکونازول: داروی ضدقارچی از گروه تریآزولها Real - Time PCR (Q-PCR): در این روش میتوان یک سکانس خاص را در DNAی هدف، جستجو و شناسایی کرد و همچنین مقدار آن را در نمونه های مورد مطالعه اندازهگیری نمود. در این تکنیک نیز اصول کلی PCR حاکم است ولی نکته حائز اهمیت این است که پس از تکثیر DNA در هر سیکل، غلظت دقیق آن اندازه گیری میشود. |
| ذینفعان نتایج طرح |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| صنم نامی | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| لیلی عاقبتی | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| سیامک صندوقچیان | مشاور |
| حامد همیشه کار | مشاور |
| بهزاد برادران | مشاور |
| پرویز حسن پور | همکار اصلی |
| بهناز بهاری باروقی | دانشجوی مالک پایان نامه |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر داروی لیپوزومال وریکونازول در درمان گونههای مقاوم به فلوکونازول کاندیدا آلبیکنس اثرات مطلوبی داشت.متن خبر داروی خط اول درمان در کاندیدیازیس مهاجم با عامل اتیولوژیک کاندیدا آلبیکنس، داروی وریکونازول است. در سالهای اخیر شاهد گونههای مقاوم به این دارو بوده که بدلیل افزایش بیان ژنهای ERG11, Cdrp1, Cdrp2 در گونههاست. بنابراین امروزه محققان بدنبال راههایی برای بهینه سازی داروهای موثر در درمان گونههای مقاوم میباشند.در مطالعه حاضر با استفاده از فرمولاسیون جدیدی از داروی وریکونازول (لیپوزومال وریکونازول) شاهد نتایج مطلوبتری در گونه های مقاوم بوده که نیاز به مطالعات جامع تری در شرایط in vivo می باشد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
