اثر آسیب نخاعی متوسط بر عملکرد شناختی، میزان آپوپتوز و بیان گیرنده های دوپامینی D1 و D5 در هیپوکمپ موش های صحرایی نر

مجریان: پرویز شهابی

خلاصه روش اجرا: برای انجام این پژوهش از مدل حیوانی موش صحرایی استفاده خواهد شد .تمام پروسیجرهای این پژوهش مطابق با آئین نامه کمیته اخلاقی و انستیتوی ملی استفاده مهرآمیز ازحیوانات آزمایشگاهی انجام خواهد شد و تمام قوانین مربوط به بیانیه هلسینکی در مورد استفاده و مراقبت از حیوانات در طول تمام مراحل پروسیجر رعایت خواهد شد. گروه‌های حیوانی مورد مطالعه: در این مطالعه در هر گروه از 10 سر موش صحرایی نر بالغ (سه ماهه) نژاد ویستار با وزن 250-300 گرم استفاده خواهد شد. رت ها در محیط با دمای کنترل شده (23 درجه سانتی گراد و 50% رطوبت) و نور مناسب و دسترسی به غذا و آب و با سیکل 12 ساعت روشنایی/تاریکی نگه داری می‌شوند. به منظور عادت کردن حیوانات به شرایط آزمایشگاهی، 3 روز قبل از جراحی حیوانات به اتاق جراحی آورده خواهند شد تا به محیط آزمایشگاه عادت کنند. موش‌های صحرایی نر به شکل تصادفی به 3 گروه آزمایشگاهی تقسیم می‌شوند (در هر گروه از 10 سر موش استفاده خواهد شد). گروه اول گروه کنترل می باشد که هیچ مداخله‌ای را دریافت نخواهند کرد. گروه دوم گروه شم بوده که تحت جراحی لامینکتومی قرار می‌گیرند. گروه سوم گروه مبتلا به آسیب نخاعی می‌باشد که تحت جراحی لامینکتومی و القا آسیب نخاعی قرار می‌گیرند. لامینکتومی و القا آسیب نخاعی: حیوانات گروه‌های دو و سه برای جراحی لامینکتومی، با تزریق mg/kg 100 کتامین و mg/kg 10 زایلازین بشکل داخل صفاقی بیهوش می شوندسپس از ناحیه خلفی موش صحرایی توسط تیغ جراحی، پوست و عضلات پاراورتبرا ستون فقرات، برش داده شده استخوان لامینا نخاع در مهره T10 لامینکتومی شده و نخاع کاملاً قابل مشاهده می‌شود. حیوانات گروه دوم فقط تحت جراحی لامینکتومی قرار می گیرند اما حیوانات کروه سوم پس از این مرحله بلافاصله تحت القا آسیب نخاعی با استفاده از دستگاه مدل آسیب نخاعی (NSRC impactor) موجود در آزمایشگاه مرکز تحقیقات اعصاب قرار خواهند گرفت. به این ترتیب که با نیرویی معادل 150کیلوداین، آسیب متوسط در ناحیه T10 سطح نخاع وارد خواهد شد. جهت اثبات متوسط بودن آسیب وارده با این نیرو، به صورت پایلوت تست رفتاری BBB انجام می شود که مقیاسی برای سنجش میزان نقص حرکتی در اندام تحتانی و فوقانی رت می باشد و اگر رتهای مبتلا به آسیب نخاعی در ناحیه T10، با توجه به پارامترهای حرکتی خاص، از صفر تا 21، میانگین امتیاز 12 یا 13 را دریافت کنند، آسیب وارده متوسط در نظر گرفته می شود مراقبت پس از جراحی: جهت درمان¬های حمایتی، بعد از اتمام هر جراحی (لامینکتومی و القا آسیب نخاعی)، جهت جلوگیری از دهیدراتاسیون، 2 میلی لیتر سالین به حیوان به صورت داخل صفاقی تزریق می‌شود. همچنین برای محدود کردن دردهای پس از جراحی باید mg/kg 5 کتو پروفن به صورت زیر جلدی یک بار در روز به مدت سه روز پس از آسیب تزریق شود. جهت جلوگیری از عفونت نیز mg/kg 8 سیپروفلوکساسین به صورت زیر جلدی یک بار در روز و به مدت یک هفته پس از آسیب تزریق شود. قبل از انجام تست های رفتاری ، برای جلوگیری از آسیب‌های ناخواسته و در اصطلاح آسیب های غیرجراحی دوره ریکاوری، هر حیوان به صورت انفرادی، در یک قفس با پوشال ضخیم نگهداری خواهد شد، پلت حیوان خیسانده خواهد شد و در قفس ریخته خواهد شد تا حیوان برای خوردن آن متحمل حرکتی اضافی نشده و دچار آسیب احتمالی نشود. برای دادن آب نیز از بطری های دارای نازل طویل استفاده می شود تا حرکت حیوان برای نوشیدن آب را کمتر کند. قفس حیوان هر 3 روز یکبار تعویض و بعد از شستشو با الکل 70 درجه ضدعفونی می‌شود تا احتمال وقوع عفونت به حداقل رسانده شود. دستکاری حیوانات توسط فرد ماهر انجام خواهد شد. در صورت رخداد هرگونه عفونت یا عارضه اضافی بر فرآیند استاندارد، حیوان حذف خواهد شد. در حیوانات گروه سوم، پس از ایجاد آسیب نخاعی به دلیل بروز شوک نخاعی و درنتیجه از بین رفتن رفلکس تخلیه ادرار، تا زمان بر گشتن رفلکس ادراری (7روز)، مثانه با ماساژ ملایم دست از طرف بدنه مثانه به طرف مجرای ادراری هر روز دوبار تخلیه می شود. تست‌ رفتاری: پس از اتمام دوره ریکاوری (2 هفته) جهت سنجش عملکرد شناختی تست ‌OX MAZE به کار گرفته می شود. در این تست‌ با توجه به فلج شدن اندام تحتانی به دنبال القا SCI ، نیاز به حرکت اندام تحتانی حداقل است. در گروه‌های دو، سه پس از جراحی و سپری شدن دوره ریکاوری تست‌های مذکور انجام می‌گیرد و با داده‌های گروه کنترل مقایسه می‌شود. OX MAZE: این تست رفتاری با هدف مطالعه حافظه فضایی، یادگیری و افتراق بینایی ایجاد شده است. از یک جعبه مکعبی سیاه به ابعاد 30×60×60 تشکیل شده است که کف آن توسط خطوطی به 25 مربع 12×12 تقسیم شده است. چهار بلوک سیاه به ابعاد 10×10×10 در باکس‌های مربعی قرار می‌گیرد. درهر بلوک از چهار طرف سوراخ‌هایی در مرکز به قطر و عمق 2×2 ایجاد شده است و هر کدام توسط یکی ازچهار نماد O ، X،= ،II علامت گذاری شده است. پس از هر بار تست ماز توسط اسید استیک 1% تمیز می‌شود. دو روز قبل از شروع تست رت ها از تکه‌های میوه یا پاداش مورد نظر دریافت می کند تا taste habituation صورت بگیرد. از 24 ساعت قبل از شروع تست رت ها را تحت محدودیت غذایی قرار می دهند (کاهش 90%نسبت به مقدار نرمال). طول کل هر دوره 10روز است و تعداد دفعات تست برای هر رت یک بار در روز و هر بار به مدت ده دقیقه می باشد. یک تکه میوه یا شکلات در داخل سوراخ موقعیت O به عنوان پاداش قرار داده می شود. رت در وسط ماز قرار می گیرد و ده دقیقه فرصت داده می شود تا به جستجو بپردازد و پاداش‌ها را بیابد. در تمام 10 روز پاداش در موقعیت O قرار می‌گیرد و موقعیت بلوک ها نیز هر روز تغییر می کند(ساعتگرد). در این تست پارامترهای زیر مورد بررسی قرار می گیرد: 1)زمان پیدا کردن اولین پاداش(latency) 2) مدت زمان تکمیل تست (یافتن هر چهار پاداش). بیشترین زمان 10 دقیقه خواهد بود 3) نسبت تعداد انتخاب های درست به انتخاب های نادرست (حتی حفره‌ای که قبلاً در آن پاداش بوده نیز انتخاب نادرست در نظر گرفته می شود.) اندازه گیری بیان گیرنده‌هایD1 و D5 توسط وسترن بلاتینگ: پس از پایان تست های رفتاری سنجش عملکرد شناختی ، تمام رتها در هر سه گروه در روز بیست و چهارم، با انجام روش مرگ آسان کشته می‌شوند و جهت بررسی میزان بیان ژن‌های گیرنده‌های D1 و D5، هیپوکمپ آن‌ها جدا شده و در دمای 80 - درجه سانتی گراد نگه داشته می شوند. بافت پس از خارج شدن در Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) هموژن و Sonicate می شود و سپس سانتریفیوژ می شود. پس از جدا شدن Supernatant غلظت پروتئن با استفاده از روش برادفورد تعیین شده و نمونه های پروتئینی روی ژل الکتروفورزر سدیم دودسیل سولفات پلی آکریل آمید جدا و به غشاهای نیتروسلولز منتقل خواهند شد. هر نمونه شامل پروتئین های یک حیوان خواهد بود. غشاها برای یک ساعت در دمای اتاق در شیر بدون چربی 5٪ در بافر TBS بلاک خواهند شد.سپس آنتی بادیهای اولیه بر علیه D1 و D5 در طول شب در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه خواهد شد. پس از شستشو با بافر TBS با آنتی بادی ثانویه با Horseradish peroxidase برای 1.5 ساعت در دمای اتاق انکوبه خواهد شد. Blots با استفاده از عمل chemiluminesence مشاهده خواهند شد و برای آنالیز باندها نرم افزار آنالیز تصاویر (Imagej) مورد استفاده قرار می گیرد. در این مطالعه House keeping protein پروتئین بتا اکتین است. همانطور که گفته شد برای حذف کردن حیوان از روش مرگ آسان استفاده خواهد شد. به این ترتیب که هر یک از حیوانات در یک محفظه در معرض گاز CO2100% قرار خواهند گرفت. میزان پر شدن محفظه به شکلی خواهد بود که در یک دقیقه 30-10% از فضای محفظه با گاز CO2 پر خواهد شد به این ترتیب حیوان دچار بیهوشی سریع با حداقل استرس خواهد شد (مثلاً" برای 10 لیتر هوای داخل محفظه باید از جریان 3-1 لیتر در دقیقه استفاده کرد). زمان مورد انتظار برای بیهوشی حیوان 3-2 دقیقه است. حیوان را از نظر فقدان تنفس و خشک و کم رنگ شدن چشم بررسی خواهیم کرد. در صورت عدم تنفس حداقل برای یک دقیقه دیگر نیز اجازه خواهیم داد که گاز CO2 ادامه یابد. اگر هر دوی این علائم مشاهده شد، می‌توانیم حیوان را از گاز CO2 جدا کنیم. اگر حیوان در عرض 3-2 دقیقه بیهوش نشد، محفظه‌ای که حیوان را قرار داده‌ایم،باید از نظر منبع گاز و غلظت گاز چک شود. رنگ آمیزیTUNEL پس از ثبوت و آماده سازی مقاطع بافتی از هر نمونه 5 برش (با استفاده از دستگاه میکروتوم روتاری به ضخامت 3 میکرومتر و بر روی لامهای سیلانه منتقل می شوند . روش تشخیصی سلولهای آپوپتیک با استفاده از رنگ آمیزی تانل انجام می شود که پروتکل آن به طور مختصر به شرح زیر می باشد: ابتدا مقاطع بافتی مورد نظر در محلول پروتیناز K انکوبه می شوند. سپس لام مورد نظر به وسیله PBS شستشو داده می شود. برای نفوذ پذیر کردن مقاطع بافتی مورد نظر به مدت دو دقیقه در یخ قرار گرفته و سپس محلول Mixture Reaction Tunel به هر مقطع بافتی افزوده شده و به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شوند. محلول POD-Converter به هر لام اضافه شده و سپس لامها با PBS شستشو داده می شوند . در نهایت ماده کروموژن DAB به هر نمونه افزوده می شود. دوباره لامها با PBS شسته شده و پس از خشک شدن به مدت 5-20 دقیقه در دمای 15-25 درجه سانتی گراد انکوبه می شوند. از هر نمونه سه لام به طور تصادفی انتخاب می شود و در هر لام 5 فیلد به وسیله میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی x400 فتومیکروگراف تهیه می گردد.سپس سلولهای آپوپتیک با استفاده از نرم افزار Image J شمارش می شوند.