بررسی اثرات زودگذر و پایدار Cdk9 بر بیان microRNA اختصاصی قلب (miR-1, miR-133 , miR-206) در مسیر تمایز سلولهای قلبی
Investigation of transient and stable induction of Cdk9 on MyomiRs (miR1, miR-133 and miR-206) experssion in the cardiac differentiation
مجریان: وحیده طرح ریز
خلاصه روش اجرا: با توجه به اینکه یکی از عوامل موثر در تکامل سلولهای قلبی ژن Cdk9 می باشد بنابراین یکی از روشهای بررسی مکانیسم این ژن، افزایش بیان آن با دستورزیهای ژنتیکی است. بدین منظور: ابتدا حامل pCEP4 تحت واکنش های اختصاصی و به کمک آنزیم های محدود الاثر برش و سپس محصول PCR کدکننده ژن Cdk9 به کمک آنزیم T4 DNA Ligase به pCEP4 متصل خواهد گردید. جهت تکثیر پلاسمید از طریق Transformation، پلاسمید وارد باکتری (DH5α) E.Coli گردیده و از آنرو که این پلاسمید ها جهت انتقال به درون سلول ها استفاده خواهند شد، پس از تایید صحیح کلونینگ، بوسیله عمل توالی یابی، در مقدار انبوه بوسیله کیت Qiagen-Midiprep از کشت شبانه باکتری جداسازی و خالص سازی خواهد گردید. کشت سلول های C2C12 به عنوان یک سل لاین از بانک سلولی انیستو پاستور ایران تهیه خواهد شد این سلولها در محیط کشت DMEM+FBS 10% در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد و CO2 5% کشت داده و قبل از رسیدن سلول ها به Confluency 70-80% سلولها را به دو حالت ترانسفکت می نماییم. 1- ترانسفکت یا انتقال پلاسمید Cdk9/pCEP4 به سلولهای C2C12 در حالت زودگذرا با استفاده از لیپوفکتامین و 2- ترانسفکت یا انتقال پلاسمید Cdk9/ pCEP4 به سلولهای C2C12 در حالت پایدار توسط روش الکتروپوریشن. آزمایشات Real Time-PCR و وسترن بلات از سلول های ترانسفورم شده در هر دو حالت گذرا و پایدار برای تایید افزایش بیان Cdk9 استفاده خواهد شد. بعد از تایید نهایی از افزایش بیان ژن Cdk9 در سلولهای ترانسفکت شده چه در حالت گذرا و چه پایدار، سلولها در مسیر تمایز قرار خواهند گرفت. همزمان با بررسی مورفولوژی سلولها، RNA توتال سلولهای ترانسفکت شده و سلولهای کنترل استخراج و برای تعیین کمیت نانو دراپ و برای تعیین کیفیت RNA، الکتروفوز خواهند شد. جهت تایید نهایی نیاز به بررسی پیشرفت تمایز در سطح مولکولی خواهد بود که بوسیله تست ایمونو هیستو شیمی و بررسی بیان ژنهای مارکر تمایز (Mef-2C و myogenin) در جهت تمایز میوبلاست به میوسیت و تمایز میوسیت به میوتیوب به ترتیب انجام خواهد گرفت. در مرحله بعدی میزان بیان Cdk9 در مراحل مختلف تمایز به روش Real Time PCR و وسترن بلاتینگ ارزیابی و در نهایت از سلولهای ترانسفکت شده و کنترل در مرحله بدون تمایز (نقطه GM) و همچنین در مراحل مختلف تمایز (روز 1، 3 و 5) و بوسیله پرایمرهای RT اختصاصی که به صورت جداگانه برای میکرو ار ان ای های اختصاصی قلب شامل: miR-1, miR-133, miR-206 طراحی گردیده است، cDNAتهیه گردیده و میزان بیان آنها در مسیر تمایز از طرق Real-Time PCR مورد بررسی قرار خواهد گرفت. در نهایت اثرات مستقیم افزایش بیان ژن Cdk9 بر روی سطح بیان ژنهای مهم و درگیر در پدیده myogenesis شامل: Myo-D, Mef-2C, Myogenesis در هر دو حالت گذرا و پایدار و در مراحل مختلف تمایز (روز 1، 3 و 5) بوسیله Real Time-PCR و وسترن بلاتینگ ارزیابی خواهد گردید. بررسی افزایش بیان Cdk9 و اثرات آن در کیفیت تکثیر سلولهای ترانسفکت شده بوسیله دو تست Doubling Time و تست MTT انجام گردیده و میزان آپوپتوز و نکروز به وسیله فلوسایتومتری مشخص خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 62602 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی اثرات زودگذر و پایدار Cdk9 بر بیان microRNA اختصاصی قلب (miR-1, miR-133 , miR-206) در مسیر تمایز سلولهای قلبی |
| عنوان لاتین طرح | Investigation of transient and stable induction of Cdk9 on MyomiRs (miR1, miR-133 and miR-206) experssion in the cardiac differentiation |
| نوع طرح | گرنت پژوهشی |
| اولویت طرح | مکانیسم سلولی مولکولی اثربخشی فرآوردههای دارویی، ترکیبات بیولوژیک |
| نوع مطالعه | مطالعه برای ساخت دارو یا وسائل |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | خير |
| مقطع پایان نامه | |
| مدت اجرا - ماه | 12 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | امروزه شمار زیادی از مردم دنیا از بیماریهای قلبی ناشی از آسیبدیدگی بافتهای آن رنج میبرند که بعضاً منجر به مرگ نیز میشود[1]. ترمیم بافتهای آسیبدیده، همواره یکی از دغدغههای متخصصین علوم پزشکی بوده و می باشد. قبل از این تصور میشد که سلولهای قلبی، سلولهایی هستند که خاصیت ترمیم و بازسازی ندارند اما به تازگی محققان متوجه شدند که داخل خود قلب، سلولهایی از نوع سلولهای بنیادی وجود دارد که میتوانند وظیفه ترمیم را بهخوبی انجام دهند منتهی فعالیت این سلولها تا حدی است که یک انسان عمر طبیعی داشته باشد و تقریبا هر چهارپنج سال یکبار تمام سلولها تجدید میشوند[2] اما اگر حادثهای غیرطبیعی مثل سکته قلبی برای فردی اتفاق بیفتد و تعدادی از سلولها از بین بروند، جایگزینی برای سلولهای از دست رفته وجود ندارد چراکه سلولهای بنیادی آن مناطق که وظیفه بازسازی و ترمیم را بر عهده دارند نیز از بین رفتهاند به همین دلیل است که بحث استفاده از سلول درمانی برای ترمیم قلب بویژه در بیماری سکته حاد مطرح است و برای پیشگیری از بروز نارسایی مزمن حاصل از این بیماری قلبی از سلول درمانی استفاده میشود. بطوریکه در بعضی از مطالعات، بیماران مبتلا به نارسایی قلبی غیر ایسکمیک و ارثی با استفاده از سلول درمانی توانسته اند تحت درمان قرار گیرند. موارد فوق بیان کننده اهمیت هر چه بیشتر مطالعات مربوط به مسیرهای ملکولی تنظیمی در توسعه و تمایز سلولهای قلبی و بهینه سازی سلول درمانی در بیماری های قلبی است[3, 4]. سالهاست که ژن Cdk9 به عنوان یکی از ژن های مهم و مرتبط با تکامل سلولهای قلبی و حتی برخی از بیماری های قلبی شناخته شده است و با ایجاد موتاسیونهای متعدد در این ژن اهمیت ژنتیکی آن بارها مورد بررسی قرار گرفته است[5-8]. اما با گسترش پژوهش ها در زمینه اپی ژنتیک و نقش آن در ایجاد بیماری ها و همچنین کشف و افزایش روز افزون اهمیت microRNA ها به عنوان بعدی از اپی زنتیک امروزه بررسی تاثیر microRNA ها در تکامل سلولهای قلبی نیز بسیار مورد توجه قرار می گیرد[9]. microRNA ها، در واقع دسته ای جدید از ملکولهای RNA غیر کدکننده (Non-coding RNA) با طول تنها 16-29نوکلئوتیدی و توالی تک رشته ای از RNA هستند که پس از رونویسی تاثیر در میزان بیان ژن دارند، در حال حاضر بیش از 2000 mi(cro)RNA در پستانداران شناسایی شده است که به طور بالقوه مشخص شده نزدیک به نصف آنها هدفشان ژنهای سنتز کننده پروتئین می باشد [10, 11]. به عبارت دیگر تنظیمات رونویسی تا حدود زیادی در توسعه تمایز سلولهای قلبی شناخته شده اند اما تاکنون تعداد معدودی از تنظیم کننده های پس از رونویسی در این مسیر مشخص شده است که مهمترین آنها شامل: mir-1, mir-133, mir-206 و mir-208 است که مجموعاmyomiRs نامیده می شود [9, 10, 12, 13]. در مطالعات اخیر سعی بر این شده است که ارتباط بین myomiRs ها و ژن های دخیل در تکامل سلولهای قلبی نشان داده شود بطوریکه مشخص گردیده myomiRs ها با تنظیم دقیق ژن های قلبی و ایجاد تعادل ما بین تکثیر و تمایز سلولی در تکامل طبیعی قلب و همچنین در ایجاد بیماری های مختلف قلبی نقش کلیدی دارند[14]. کشف myomiRs ها و بررسی آنها نه تنها یک روش نوین در مطالعه مسیرهای ملکولی تنظیمی در توسعه و تمایز سلولهای قلبی است بلکه یک فرصت جدید در گسترش روشهای درمانی نو در بیماریهای قلبی نیز می باشد. در این مطالعه نقش تنظیمی ژن Cdk9 بر بیان miR های قلبی بویژه miR-1, miR-133, miR-206 در مسیر تمایز سلول های میوبلاست C2C12 بررسی می شود و بدین منظور یکبار با استفاده از لیپوفکتامین 2000 جهت بررسی اثر گذرا (Transiat) ژن Cdk9 به سل لاینهای C2C12 - به عنوان سلولهای رایج در بررسی microRNA های اختصاصی ماهیچه ای و قلبی - انتقال داده می شود و یک بار دیگر بوسیله مکانیسم الکتروپوریشن جهت برررسی بیان پایدار (stable ) ژن Cdk9 انتقال داده خواهد شد پس از انتقال سازه، افزایش بیان Cdk9 هم در یبان Transiat و هم Stable با روش Real Time PCR و Western Blot تایید شده و سل لاینها در محیط تمایزی قلب قرار داده می شوند. صحت مسیر تمایز بوسیله تست ایمونو هیستو شیمی و مارکر های اختصاصی تمایز انجام خواهد گرفت. به منظور مطالعه تاثیر افزایش بیان ژن Cdk9 بر microRNA های اختصاصی قلب در طی تکامل سلولهای قلبی، ابتدا میزان بیان سه میکرو ار ان ای مهم قلبی شامل: (miR-1, miR-133 and miR-206) با استفاده از روش Real Time PCR بررسی شده و در ادامه نحوه تاثیر آن بر تمایز سلول های C2C12 به دو طریق مطالعه می شود. در مرحله اول میزان بیان ژن های اختصاصی قلبی مانند SRF و myH-7, Myo-D, myH-6 اندازه گیری شده و با سلول های کنترل مقایسه می شود و در ادامه مورفولوژی سلول ها در روند تمایز بررسی خواهد شد. |
| اهداف اختصاصی | کلون کردن ژن Cdk9 در حامل pCEP4 تحت یک پروموتر قوی جهت افزایش بیان -افزایش بیان Cdk9 بصورت زودگذر و پایدار در سل لاین های C2C12 و بررسی تاثیر هر دو حالت در مسیر تمایز سلولهای قلبی -بررسی تاثیر افزایش بیان Cdk9 بر بیان microRNA اختصاصی قلب (miR-1, miR-133, miR-206) در طول مسیر تمایز سلول های C2C12 -مطالعه مکانیسم تنظیمی موجود مابین Cdk9 و ژنهای درگیر در مسیر تمایز در هر دو حالت القای زودگذر و پایدار ژن Cdk9 |
| چکیده انگلیسی طرح | |
| کلمات کلیدی | Cdk9: ژن Cdk9 به عنوان یکی از ژنهای مهم در تکامل قلب شناخته شده است در واقع موتور و هسته مرکزی کمپلکس p-TEFb بوده که باعث فسفریلاسیون و فعال سازی RNA پلیمراز II در جهت رونویسی از ژنهای مسیر تمایز سلولهای قلبی می گردد. myomiRs: ملکولهای RNA غیر کدکننده (Non-coding RNA) با طول تنها 16-29نوکلئوتیدی و توالی تک رشته ای از RNA هستند که بعنوان تنظیم کننده های پس از رونویسی در مسیر تمایز سلولهای قلبی مشخص شده اند و مهمترین آنها شامل: mir-1, mir-133, mir-206 و mir-208 است که مجموعاmyomiRs نامیده می شود. تمایز سلولی: مجموعه تغییرات و تحولات ساختاری، شیمیایی و عملی را که موجب میشوند از تودهای از سلولهای همسان (هم ارزش)، سلولهای تخصص یافته بوجود آیند یا موجب شوند که سلولی در طول زمان نسبت به گذشته خود متفاوت شود را تمایز سلولی گویند. |
| ذینفعان نتایج طرح | افرادی که مشغول فعالیت و تحقیق در زمینه بیماریهای قلب و عروق می باشند. دانشگاه های علوم پزشکی و مراکز تحقیقاتی |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| محمد سعید حجازی | همکار اصلی |
| وحیده طرح ریز | مجری اول (اصلی-هیات علمی) |
| شیرین عیوضی | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر کیناز وابسته به سایکیلن 9 با دستکاری میکروار ان های قلبی باعث تمایز قلب می گردد.متن خبر کوچکترین نارسایی در ساختار یا عملکرد قلب می تواند عواقب فاجعه باری به همراه داشته باشد. در این طرح نقش تنظیمی ژنCdk9 یک کیناز وابسته به سایکلین 9 ( که در تمایز سلولهای قلبی نقش مهمی دارد) بر بیان miRهای قلبی- عضلانی در مسیر تمایز سلول های میوبلاست C2C12 قلبی مورد بررسی قرار گرفت و در ادامه نحوه تمایز سلولی و مکانیسم مولکولی مرتبط با آن بررسی شد. یافته ها حاکی از آن است که یک افزایش زودگذر در بیان Cdk9 می تواند باعث تسریع در روند تمایز سلولهای قلبی با دستکاری در پروفایل بیانی میکرو ار ان های قلبی گردد. این یافته ها کمک می کند تا بتوان شرایطی فراهم کرد که در آینده نزدیک یک شبکه microRNAهای قلبی- عضلانی را در سلولهای بالغ مانند فیبروبلاست فعال ساخت. در اینصورت محققین قادر خواهند شد تا با استفاده از روش نوین یک دورنمایی در پیشگیری و درمان بیماری قلبی ایجاد نمایند. |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر بیان ژن Cdk9 با تغییر در پروفایل بیانی microRNA های قلبی به تسریع روند تمایز کمک می کندمتن خبر افزایش زودگذر در بیان ژن Cdk9 در ابتدا باعث افزایش در ژنهای MyoD, Myogenin, Mef2 می گردید. همچنین در بررسی پروفایل بیانی microRNA های مهم قلبی- عضلانی یک افزایش بیان بسیار چشمگیر در میزان miR-1 و افزایش بیان معنی داری در سطح miR-206 و یک کاهش محسوس در میزان بیانmiR-133 ایجاد می گردد. که همین امر موجب سرکوب تکثیر میوبلاست ها و تشویق آنها در تسریع و شروع روند تمایز می شود. این در حالیست که یک بیان پایدار از این ژن نه تنها موجب یک بی نظمی در پروفایل بیانی سه miR مهم قلبی- عضلانی(miR-1, miR-133, miR-206) نسبت به سلولهای کنترل می گردد بلکه افزایش در بیان فاکتور های مهم رونویسی نیز متوقف می گردد. حتی در اواخر مراحل تمایز، کاهش بیان بویژه در Mef-2 نیز مشاهده گردید. بنابراین اگرچه یک افزایش زودگذر در بیان Cdk9 می تواند در تسریع روند تمایز کمک می کند ولی بیان ممتد، آن هم در سطح بالا نه تنها کمکی به تمایز نمی کند. بلکه با بهم ریختگی در پروفایل بیانی microRNA های قلبی- عضلانی مانع روند طبیعی و نرمال تمایز نیز می گردد. و در نهایت سلول را به سمت مرگ سلولی هدایت می کند. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر کیناز وابسته به سایکیلن 9 با دستکاری میکروار ان های قلبی باعث تمایز قلب می گردد.متن خبر . |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر بیان ژن Cdk9 با تغییر در پروفایل بیانی microRNA های قلبی به تسریع روند تمایز کمک می کندمتن خبر . |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
