بررسی افزایش بیان محلول آنتی بادی های تک زنجیره ای در E. coli از طریق چاپرونها

مجریان: صفر فرج نیا

خلاصه روش اجرا: باکتری E. coli BL21 حاوی سازه های ژنی بیان کننده scFv با پلاسمیدهای حاوی ژن چاپرونی ترانسفورم می گردد. باکتری های حاوی پلاسمید چاپرونی و پلاسمید حاوی آنتی بادی در محیط مایع حاوی آمپی سیلین و کلرامفنیکل جهت غربال سلول های حاوی هر دو پلاسمید در حضور L-Arabinose و تتراسیکلین جهت القای بیان مولکول های چاپرون در دمای 37 درجه سانتی گراد کشت داده خواهند شد. زمانی که OD در A600 به حدود 0.5 برسد IPTG برای بیان آنتی بادی افزوده خواهد شد. 6 ساعت بعد ازعمل القا، انکوباسیون متوقف و سلول ها به وسیله سانتریفیوژ جمع آوری خواهند شد. با استفاده از بافر لیز کننده و سونیکاسیون سلول ها لیز خواهند شد که محصول بدست آمده محتوی کل پروتئین سلولی می باشد که مخلوطی از پروتئین های محلول و نامحلول در سیتوپلاسم است. برای جدا کردن پروتئین های محلول، از سانتریفیوژ استفاده خواهد شد. جهت بررسی تاثیر بیان همزمان دو ترکیب مختلف از مولکول های چاپرون بر روی میزان حلالیت آنتی بادی از روش SDS-PAGE استفاده خواهد شد. همچنین برای بررسی عملکردی بودن آنتی بادی تولیدی از تست الایزا استفاده خواهد شد. جهت بررسی عدم تداخل چاپرونهای خود باکتری از کنترل بیان در سلولهای بدون پلاسمید چاپرون استفاده خواهد شد. فولدینگ صحیح پروتئین از طریق محلولیت توام با فعالیت صحیح در واکنش با آنتی ژن هدف از طریق تستهای الیزا مورد بررسی قرار خواهد گرفت