مهار ترکیبی CD73وکینازهای وابسته با سایکلین (CDKs) در رده های سلولی سرطانی در محیط کشت سلولی
Co-inhibition of CD73 and Cycline Dependent Kinases (CDKs) in tumor cell lines in vitro
مجریان: فرهاد جدیدی نیارق
خلاصه روش اجرا: خلاصه روش اجرا: این مطالعه دو فاز دارد: ۱.تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات حاوی SiRNA : ابتدا با واکنش کیتوزان و اسید لاکتیک ترکیب کیتوزان لاکتات را تولید می کنیم. سپس باید نانوذرات کیتوزان لاکتات RNA مداخله گر را در بر بگیرند. کیتوزان لاکتات پتانسیل بالایی برای کپسوله کردن SiRNA و حفاظت از آن در برابر تخریب سرمی دارد. تشکیل نانو ذرات کیتوزان لاکتات در اثر تعاملات یونی بین کیتوزان لاکتات و SiRNA حل شده در سدیم تری پلی فسفات ( SiRNA/TPP ) صورت می گیرد. و نانوذرات حاویSiRNA تولید می شوند که خصوصیات فیزیکو شیمیایی آن ها بررسی می شود. تولید کمپلکس نانوذرات-SiRNA با ژل اکتروفورز در ژل 2% آگارز تایید می شود و میزان بارگیریSiRNA به صورت کمی بوسیله روش اولتراسانتریفیوژ بررسی خواهد شد. از رده های سلول های سرطانی 4T1 (سرطان پستان) و CT26 ( سرطان کلون ) و B16F10 ( ملانوما ) در این مطالعه استفاده خواهد شد که مطالعات گذشته بیانCD73 توسط آن ها را اثبات کرده است و میزان تولید آن نیز در هر رده سلولی متفاوت است. این رده های سلولی در محیط RPMI1640 حاوی 10%fetal bovine serum و آنتی بیوتیک کشت داده می شوند. پس از گذشت ۲۴ ساعت از کشت سلولی نانوذرات حاوی SiRNA را به همراه داروی مهارکننده CDKs (Dinaciclib) به محیط کشت هر رده سلولی اضافه می کنیم. میزان تاثیر نانوذرات بارگیری شده با SiRNA بر روی بیان ژن CD73 در کشت سلول ها توسط تکنیک Real-time PCR در فواصل زمانی مختلف بررسی می شود. تاثیر نانوذرات حاویSiRNA بر روی حیات سلولی توسط آزمون MTT ارزیابی می شود. علاوه بر این میزان تاثیر نانوذرات بارگیری شده با SiRNA بر روی فاکتورهای پیش آپوپتوزی (Bax) فاکتورهای ضد آپوپتوزی (Bcl-2 ) فاکتورآنژیوژنز(VEGF) فاکتورهای متاستاز (MMP2, MMP9) با استفاده از تکنیک Real-time PCR در فواصل زمانی مختلف بررسی می شود.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 62195 |
| عنوان فارسی طرح | مهار ترکیبی CD73وکینازهای وابسته با سایکلین (CDKs) در رده های سلولی سرطانی در محیط کشت سلولی |
| عنوان لاتین طرح | Co-inhibition of CD73 and Cycline Dependent Kinases (CDKs) in tumor cell lines in vitro |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | ایمونوتراپی بیماریهای شایع با استفاده از ژن درمانی |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | خیر |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | دکتری عمومی |
| مدت اجرا - ماه | 14 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | نوآوری و ضرورت اجرای طرح: کینازهای وابسته به سایکلین (CDKs) از جمله مهمترین پروتئین های تنظیم کننده¬ی چرخه¬ی سلولی هستند و اختلال در عملکرد آن¬ها یکی از عوامل مهم ایجاد سرطان است. اختلال در این پروتئین¬ها با واسطه¬ی مسیرهای داخل سلولی مانند ERK، JNK، MAPK و STAT3 بر روی فاکتورهای موثر در سرطان از جمله تکثیر سلولی، آنژیوژنز، ایجاد ریزمحیط مهاری، متاستاز و اختلال ترمیم DNAاثر میگذارد. همچنین این پروتئین¬ها به واسطه¬ی اثر گذاری روی مسیرهای ذکر شده، سبب افزایش بیان CD73 می¬گردند که سبب ایجاد شرایط غنی از آدنوزین در محیط تومورشده که می توانند فعالیت ضد توموری سلول های T و NK را مهار کنند و نقش مهمی در مکانیسم فرار تومور ایفا کند. همچنین آدنوزین با واسطه ی اثر روی مسیرهای ERK، JNK و MAPK سبب فعالیت بیشتر مسیر STAT3 و به دنبال آن افزایش بیان CD73 شود. مطالعات جداگانه زیادی برای مهار CDKs و CD73 انجام شده است که گاها به علت اختصاصی نبودن عوارض جانبی زیادی داشتند. در مطالعه حاضر تلاش می¬شود تا با مهار همزمان دو فاکتور عنوان شده با استفاده از داروی Dinaciclib به عنوان یک CDK inhibitor و RNA مداخله گر علیه CD73، به دنبال جلوگیری از رشد، تکثیر وآنژیوژنز و در نتیجه جلوگیری از پیشرفت تومور بوده و درمان موثری برای سرطان¬های مورد نظر ارائه نمود. |
| اهداف اختصاصی | تهیه ی نانو ذرات کیتوزان لاکتات حاوی SiRNA -بررسی خصوصیات ذرات تشکیل شده -فاز دوم: مطالعه in vitro اثر بخشی نانو ذرات تهیه شده بررسی سمیت سلولی و اثر مهار کنندگی رشد سلولی در طی زمان توسط آزمون MTT -مطالعه in vitro اثر بخشی درمان ترکیبی بر روی بیان ژن های پیش برنده آپوپتوز، مهار کننده آپوپتوز، آنژیوژنز و متاستاز سلول های سرطانی با روش Real-time PCR: |
| چکیده انگلیسی طرح | Summary of the method: This study has two phases: 1. Production of chitosan lactate nanoparticles containing siRNA: First, we produce chitosan lactate compound by reacting chitosan and lactic acid. Then, chitosan lactate nanoparticles should encapsulate interfering RNA. Chitosan lactate has a high potential for encapsulating siRNA and protecting it from serum degradation. The formation of chitosan lactate nanoparticles occurs due to ionic interactions between chitosan lactate and siRNA dissolved in sodium tripolyphosphate (siRNA/TPP). And nanoparticles containing siRNA are produced and their physicochemical properties are investigated. The production of nanoparticle-siRNA complex is confirmed by gel electrophoresis in 2% agarose gel and the amount of siRNA loading will be quantitatively investigated by ultracentrifugation method. The 4T1 (breast cancer), CT26 (colon cancer), and B16F10 (melanoma) cancer cell lines will be used in this study, which have been shown to express CD73 in previous studies, and the amount of its production varies in each cell line. These cell lines are cultured in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum and antibiotics. After 24 hours of cell culture, we add SiRNA-containing nanoparticles along with the CDKs inhibitor (Dinaciclib) to the culture medium of each cell line. The effect of SiRNA-loaded nanoparticles on CD73 gene expression in cell culture is examined by Real-time PCR at different time intervals. The effect of SiRNA-containing nanoparticles on cell viability is evaluated by the MTT assay. In addition, the effect of SiRNA-loaded nanoparticles on pro-apoptotic factors (Bax), anti-apoptotic factors (Bcl-2), angiogenesis factor (VEGF), and metastasis factors (MMP2, MMP9) is investigated using Real-time PCR technique at different time intervals. |
| کلمات کلیدی | CDKs :Cyclin dependent kinases یا کینازهای وابسته به سیکلین و دسته ای از پروتئین های سرین ترئونین کیناز هستند که در پیشبرد و کنترل چرخه ی سلولی نقش اساسی دارند.CDKs بعد از اتصال به سیکلین فعال می شوند.در ساختار CDKs سه بخش اساسی وجود دارد:1) دومن N-terminal که غالبا از صفحات بتا ساخته شده است. 2) دومن C-terminal که غالبا مارپیچ الفا دارد. 3)سایت اتصال به ATP SiRNA: RNA مداخله گر (RNAi) اصطلاح کلی است که به تکنولوژی خاموشی پس از رونویسی توسط RNA دو رشته ای اطلاق گردیده و در گیاهان با اصطلاح PTGS عنوان می شود .در تکنولوژیRNA مداخله گر (RNAi) ، رشته مکمل mRNA ژن مورد نظر ساخته شده و این رشته به mRNA ژن هدف متصل و یک توالی دورشته ای (dsRNA) را بوجود می آورد. از آنجا که سیستم سنتز پروتئین قادر به ترجمه mRNA دو رشته ای نمی باشد، بیان ژن هدف متوقف و اصطلاحاً ژن خاموش می شود. Dinaciclib :یک مهار کننده قوی برای cdk1,2,5,9 می باشد وباعث القای پسرفت تومورهای solid می شود. CD73: یک پروتئین غشای پلاسمایی است که در بسیاری از سرطان ها افزایش بیان می یابد.نوکلئوتید خارج سلول ((AMP را به آدنوزین تبدیل می کند. که آدنوزین نقش مهمی در مکانیسم های سرکوب سیستم ایمنی در محیط تومور ایفا می کند. MDSC: از سلول های رده میلوئیدی است که موجب مهار پاسخ های ایمنی می شود. CD39: یک پروتئین گذرنده از غشا است که در سطح سلول های توموری و تعدادی از سلول های سیستم ایمنی بیان می شود.ATP خارج سلولی را به ADP و سپس به AMP تبدیل می کند. TGF-β: فاکتور تغییر دهنده رشد β از طریق مهار لنفوسیت ها و فاگوسیت ها باعث تعدیل و تنظیم پاسخ های ایمنی می گردد. این سایتوکین هم اثر ضد التهابی و هم اثر پیش التهابی را نشان می دهد که بسته به زمان و مقدار تولید و سیستمیک یا موضعی بودن آن دارد. TGF-β از سلول های T تحریک شده ، بیگانه خوارهای تک هسته ای فعال شده با LPS و بسیاری دیگر از سلول ها تولید می شود. STAT3: یکی از اعضای خانواده STAT است که توسط ژن STAT3 تولید می شود. در سیتوپلاسم به صورت مونومر های غیر فعال وجود دارد که در پاسخ به سایتوکین ها و فاکتور های رشد توسط JAK فسفریله شده و تشکیل همودایمر می دهد و به هسته نقل مکان کرده و با اتصال به توالی های خاص نسخه برداری ژن های مربوطه را تحریک می کند. RAF/MEK/ERK :حضور میتوژن ها و عوامل رشد باعث فعال شدن تیروزین کیناز گیرنده های کانونی مانند EGFR وافزایش دینامیکی آنها و همچنین فعال شدن GTPase Ras می شود. این نتیجه منجر به فسفریلاسیون آبشار) MAPK (Raf-MEK-ERK و در نهایت باعث فسفریلاسیون و فعال شدن ERK می شود. فعالیت ERK برای فعال کردن ژن های تنظیم کننده ی سیکل سلولی مورد نیاز است. P38 : یک پروتئین کیناز فعال با میتوژن (MAPK) است که به محرک های استرس مانند سیتوکین ها، اشعه ماوراء بنفش، شوک گرما و شوک اسموتیک واکنش نشان می دهد و در تمایز سلولی، آپوپتوز و اتوفاژی دخیل است. MCL-1: پروتئین کدگذاری شده توسط این ژن متعلق به خانواده Bcl-2 است. در این لوکوس جایگزینی اسپلایسینگ وجود دارد و دو ایزوفرم مشخص شناسایی شده است. ایزوفرم 1 با مهار آپوپتوز، بقای سلولی را بهبود می بخشد در حالی که محصول ژن کوتاه تر (ایزوفرم 2) اسپلایس شده، باعث افزایش آپوپتوز می شود. BCL-XL: این پروتئین عضوی از خانواده ی Bcl-2 است و از طریق جلوگیری از انتشار محتویات میتوکندری مانند سیتوکروم c به عنوان پروتئین ضد آپوپتوزی عمل می کند. VEGF : فاکتور رشد اندوتلیال عروق که به عنوان عامل نفوذپذیری عروقی (VPF) شناخته می شود. یک پروتئین سیگنال تولید شده توسط سلول هایی است که باعث ایجاد رگ های خونی می شوند. VEGF یک زیر خانواده از عوامل رشد است که در واسکولوژنز و آنژیوژنز نقش دارد. |
| ذینفعان نتایج طرح | درمان سرطان به دلیل قرار گرفتین سرطان در زمره بیماری هایی که هزینه فراوانی را برای جامعه و بیماران به دنبال دارد. در ایران نیز سرطان از مهم ترین معضلات سلامت عمومی است و سالانه باعث تحمیل هزینه های فراوان به بیماران و نظام سلامت شده و باعث خروج مقادیر فراوان ارز کشور برای تهیه درمان سرطان می شود. بنابراین پیدا کردن روشی برای درمان این بیماری منافع بسیاری برای بیماران و نظام سلامت خواهد داشت. |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| فرهاد جدیدی نیارق | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| شاهین حلاج | دانشجوی مالک پایان نامه |
| قاسم قلم فرسا | مشاور |
| هادی حسن نیا | مشاور |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر درمان نوین ترکیبی می تواند مانع رشد سرطان گرددمتن خبر در مطالعه انجام شده تلاش بر مهار بیماریزایی سرطان در سطح سلولی بوده و آزمایشگاهی بود که برای این منظور از روش های نوین ژن درمانی و تکنولوژی نانو استفاده کردیم. با هدف قرار دادن ژن های دخیل در تقسیم سلول های سرطانی و مولکول های مهم دخیل در پیشرفت سرطان، موفق شدیم تقسیم سلولی را مهار کنیم و همچنین پاسخ سیستم ایمنی بدن را علیه سلول های سرطانی برانگیزیم که باعث جلوگیری از رشد، گسترش و متاستاز سلول های توموری شد. این مطالعه در سطح آزمایشگاهی نتایج بسیار امیدوار کننده ای داشت و برای ورود به مرحله بالینی نیاز است که بر روی مدل های حیوانی سرطان هم آزمایش گردد تا از ایمنی و اثربخشی این روش نوین اطمینان حاصل گردد. |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر مهار CD73 و CDK یک روش موثر برای درمان سرطان می باشد.متن خبر در مطالعه حاضر نانوذرات کیتوزان لاکتات ضد C73 سبب بهبود قابل توجه در اثر ضد مهاجرتی داروی دیناسیسلیب بر روی سلول های سرطان پستان شدند. هدف این طرح توسعه روش درمان سرطان پستان بوده و با استفاده از مطالعات مولکولی دو هدف CD73 و CDK برای درمان سرطان انتخاب شدند. برای این منظور در این مطالعه استفاده از نانوذرات کیتوزان لاکتات و بارگیری آن ها با siRNA ضد C73 سبب بهبود قابل توجه در اثر ضد مهاجرتی داروی دیناسیسلیب بر روی سلول های توموری سرطان پستان مشاهده شد. همچنین این روش ترکیب درمانی جدید باعث افزایش مرگ و میر سلول های سرطانی و کاهش متاستاز شد که نشان از درمان موثر و جلوگیری از مهاجرت موثر این روش درمانی نوین است. این روش جدید با توسعه به سطح مطالعات بالینی بر روی انسان میتواند روش موثری در درمان سرطان باشد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
