بررسی تاثیر جایگزینی ژل وارتون آسلولاربا سرم جنین گاوی (FBS) بر الگوی تمایز میلوئیدی و لنفوئیدی سلول های +CD34 در هم کشتی با سلول های بنیادی مزانشیمی

مجریان: علی اکبر موثق پور اکبری , مهدی یوسفی

خلاصه روش اجرا: خلاصه روش اجرا: پیوند سلولهای بنیادی خونساز یک روش درمانی اثبات شده برای درمان بدخیمی های هماتولوژیک و بیماری های غیر بدخیم هماتولوژیکی وبیماری های نقص ایمنی میباشد. دو نوع جمعیت سلول بنیادی شامل سلول‌های بنیادی خون‌ساز (HSC) و سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSC) وجود دارد که HSCها ازنظر مارکر CD34 مثبت بوده و قادر به تولید هر سه رده‌ی سلولی خونی شامل گلبول‌های قرمز، گلبول‌های سفید و پلاکت‌ها بوده که باعث حفظ سیستم ایمنی، هموستاز خونی و عمکرد بافتی در طول زندگی انسان میشوندMSC . ها در تشکیل جایگاه تمایز و بقاء برای سلول‌های بنیادی خون‌ساز و همچنین حمایتاز خون‌سازینقش دارند. اسـتفاده از سـا یتوکائین هـا و سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSC) در محیط کشـت سلول‌های بنیادی خون‌ساز باعث حفظ ماهیت بنیادی، مهار آپوپتوز، تحریک تکثیر ومهار تمایز این سلول‌ها به رده‌های سلولی بالغ می‌شود. تکثیر سلولهای انسانی و حیوانی در خارج بدن نیاز به شرایط کشت و محیط های کشت خاص دارد. محیط کشت حاوی تمام مواد ضروری مورد نیاز برای متابولیسم، رشد و تکثیر سلول است . ترکیب پایه این محیط ها با سرم حیوانات بخصوص با سرم جنین گاوی (FBS) که رشد و تکثیر سلول ها را ارتقا میدهد تکمیل می شود. از جمله محیط هایی که میتوان به عنوان جاگزین برای سرم های حیوانی استفاده کرد، ژل وارتون اسلولار (AWJ) است.ژل وارتون آسلولار حاوی فاکتورهای رشد متعددی ازجمله: فاکتور رشد مشتق از پلاکت (PDGF)، فاکتور رشد اپیدرمال (EGF)، فاکتور رشد بازی فیبروبلاست (bFGF)، فاکتور رشد اسیدی فیبروبلاست (aFGF) ،فاکتوردگرگونی رشد بتا (TGF-β1) 1 ،فاکتور رشد شبه انسولین (IGF-I)است .تمام این مولکولها تکثیر و عملکرد سلول ها را تحت تاثیر قرار میدهند و ممکن است تکثیر را نسبت به FBS تغییر دهند. برای تمامی این فاکتورهای رشد روی سلولهای بنیادی خونساز و پیشسازهای رده های خونی گیرنده وجود دارد. در مورد نقش دقیق این فاکتور ها در گسترش سلول ها، خصوصا سلولهای بنیادی، اطلاعات کمی در دسترس است. بدلیل مشکلاتی که سرم های حیوانی دارند، مانند: آسیب به جنین حیوان هنگام جمع آوری نمونه، تولید آنتی بادی در بدن فرد گیرنده علیه ترکیبات باقی مانده از سرم حیوان، انتقال بیماری زاهای حیوانی شناخته شده و ناشناخته به فرد و از طرفی هم تا بحال مطالعه ای در مورد تاثیر ژل وارتون اسلولار بر روی تکثیر و تمایز سلول های بنیادی به سمت رده سلولی میلوئیدی و لنفوئیدی انجام نشده است . لذا ما در نظر داریم تا در این مطالعه میزان خودنوسازی سلول های بنیادی و کیفیت تمایز این سلول ها به رده ی میلوئیدی و لنفوئیدی را در حضور ژل وارتون آسلولار مورد ارزیابی قرار دهیم.در این مطالعه ابتدا ژل وارتون را از بند ناف جدا میکنیم سپس با سانتریفیوژکردن سلول ها را جدا میکنیم و ژل وارتون آسلولار حاصل می شود. سپس MSC های مشتق از خون بند ناف را در محیط DMEM کشت می دهیم. از طرفی هم سلول‌های بنیادی خون‌ساز از منبع خون بند ناف توسط روش ستونی مگنتیک(MACS)با استفاده از آنتی‌بادی‌های ضد آنتی‌ژنCD34 متصل به ذرات میکرو مگنتیک جدامی‌شوند. سپس سلول‌های جمعآوری شده از ستون، در محیط کشت القاییIMDM کشت داده می‌شوند. .به منظور بررسی اثر جایگزینی ژل وارتون آسلولار با FBS بر روند تمایز سلولهای بنیادی خونساز CD34+ به سمت رده سلولی میلوئیدی و لنفوئیدی درهمکشتی باسلولهای مزانشیمی،در پلیت های جداگانه، سلولهای CD34+ به طور مستقیم بر روی تک لایه ی سلول های مزانشیمی و مخلوط سایتوکاینی تمایز دهنده به سمت رده ی به سمت رده میلوئیدیGM-SCF و مخلوط سایتوکاینی تمایز دهنده به سمت رده لنفوئیدی IL2,IL7 اضافه می شود و یک بار درترکیب 1:1 از محیطهای کشت DMEM و IMDM حاوی ژل وارتون آسلولار و یک بار هم در ترکیب 1:1 از محیطهای کشت DMEM و IMDM حاوی FBS ویک بار در ترکیب 1:1 از محیط های کشت DMEM و IMDM حاوی PBS به عنوان کنترل منفی کشت داده می شوند.سلولهای HSC به تعداد 1x104 سلول بر روی یک لایه از سلولهای بنیادی مزانشیمی که به تراکم 80-70 درصد رسیده است، در هر محیط کشت داده خواهند شد.سلول‌های رشد کرده و تمایز یافته در این مرحله، ازنظر اندازه و بیان مارکرهای سطحی اختصاصی رده ی میلوئیدی از قبیلCD13,CD33و همچنین از نظر اندازه و بیان مارکرهای سطحی اختصاصی رده ی لنفوئیدی ازقبیلCD3,CD7,CD5,CD10توسطتکنیک فلوسایتومتری ارزیابی می‌شوند.میزان بیان ژن‌های اختصاصی رده‌ی میلوئیدی از قبیل: C/EBPα,RUNX1,PU1 ورده ی لنفوئیدی IKAROS,GATA3با استفاده از تکنیکReal Time - PCR بررسی خواهند شد. درنهایت درخصوص پارامترهای کیفی از جمله درصد بیان مارکرها از آزمون اماری مجذور کای و یا تستهای غیرپارامتریک مانند mann withny U testاستفاده خواهد شد آنالیزهای آماری با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS ver. 25 مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرار خواهد گرفت. در این مطالعه مقادیرP< 0.05ازلحاظ آماری معنی‌دار تلقی می‌گردند.