ارزیابی و مقایسه تاثیر وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول بر رشد و بیان ژنهای cyp51A و mdr1 در ایزولههای آسپرژیلوس فلاووس مقاوم به داروی وریکونازول با استفاده از تکنیک Real-time PCR
Evaluation and comparison of the effects of voriconazole and liposomal-voriconazole on the growth and cyp51A and mdr1 genes expression in voriconazole-resistant Aspergillus flavus isolates using Real-time PCR technique
مجریان: صنم نامی
خلاصه روش اجرا: در قدم اول از آسپرژیلوسهای فلاووس مقاوم و حساس (به عنوان کنترل) جدا شده از بیماران ایرانی که تعیین هویت و حساسیت گشته استفاده میشود. جهت بدست آوردن کلنی های تازه برای تهیه سوسپانسیون، کونیدیهای مورد تلقیح از آب مقطر به روی محیط پوتیتو دکستروز آگار منتقل میشوند. سپس برای تعیین MIC هر یک از ایزولههای فوق نسبت به داروی وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول به طریق in vitro و با استفاده از روش Broth microdilution و بر اساس استاندارد CLSI M38-A2 به ترتیب زیر انجام میگیرد: الف- تهیه محلول استوک از داروی وریکونازول در DMSO(µg/ml1600) فرمولاسیون¬های نانولیپوزوم¬ها با استفاده از روش ترکیبی هیدراسیون لایة نازک- سونیکاسیون، با کمی تغییرات تولید میگردد. ابتدا لستین ،کلسترول و داروی وریکونازول در غلظت مشخص در حلال حل گردیده و سپس حلال در اواپراتور روتاری تبخیر شده و لایه نازک در ته فلاسک ته گرد تشگیل میگردد. بعد با استفاده از 10 سی سی آب مقطر استریل یا بافر PBS عمل هیدراسیون لایه نازک انجام میگردد. در این مرحله لیپوزومهای مولتی لاملار تشکیل می شوند. جهت کاهش اندازۀ لیپوزوم¬ها مراحل زیر انجام میگردد. ابتدا هموژنیزاتور کردن نمونه¬ها در هموژنایزر (با سرعت rpm 20000 در دمای بالای انتقال فاز لیپوزوم¬ها به مدت 15 دقیقه) و در ادامه انتقال مخلوط لیپوزومی به داخل حمام یخ و سونیکاتور پروب و اعمال 10 سیکل 1 دقیقه¬ای با 1 دقیقه استراحت ما بین سیکل¬ها بوده؛ در این مرحله نانو لیپوزوم¬های یونی لاملار تولید میشود. ب- تهیه رقت های سریال (µg/ml 16-8-4-2-1-5/0-25/0-125/0-625/0-0313/0) از داروی فوق و ریختن آنها به میکروپلیت های 96 خانه ج- تهیه سوسپانسیون از کونیدی قارچ با غلظت 5 × 104 CFU/ml-0.4 × 104 د- اضافه کردن سوسپانسیون کونیدی به هر یک از چاهکهای حاوی رقتهای داروئی و نگهداری در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 50-46 ساعت ه- خواندن نتایج به کمک آئینه و مقایسه با چاهکهای کنترل مثبت و منفی و- تعیین MIC توجه : در بررسی تست حساسیت دارویی از استرین های کاندیدا پاراپسیلوزیس) (ATCC22019 یا کاندیدا کروزئی ( ATCC6258) جهت کنترل کیفی استفاده می شود. برای مقایسه این روش از تکنیک Real-time PCR استفاده میکنیم. بدین منظور ابتدا با توجه به حداقل غلظت مهاری MIC50 وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول ، قارچ مورد نظر را در محیط کشت PDA اگار کشت داده بعد انکوباسیون در دمای 30 درجه بمدت 48 ساعت رسوب را جدا کرده و RNA قارچ را با استفاده از کیت مربوطه استخراج میکنیم . به منظور مشاهده باندهای 28s،18s،5s الکتروفورز کرده و با اندازه گیری OD با نانودراپ میزان کمی وکیفی ارزیابی قرار می گیرد. بعد cDNA سنتز می کنیم. برای طراحی و سنتز پرایمر با استفاده ازGenBank که بانک بین المللی ژن در NCBIاست و با استفاده از BLAST، شباهت ها پردازش شده و در نهایت با توجه به شرایط مورد نظربرای طراحی پرایمرها، پرایمرهای مربوط به ژن CYP51A و MDR1 ، طراحی می شود. پرایمرها با توجه به سکانس نوکلئوتیدی ژن و β Actin بعنوان( House Keeping gene) در آسپرپژیلوس فلاووس طراحی می شود و سپس جهت ساخت به شرکت مربوطه سفارش داده می شود. جهت کمیت سنجی نسبی، میزان بیان ژن مورد مطالعه (برطبق روش CT ∆∆) در قارچ مجاور شده با غلظت MIC50مشخص وریکونازول ولیپوزومال وریکونازول و ونمونه مجاور نشده درمقایسه بامیزان میانگینCt ژن هدف CYP51A و MDR1 وژن مرجع اکتین (کالیبراتور) بر اساس فرمول های ذیل محاسبه خواهد شد. فرمول 1 (ژن بتا- اکتین) CT- ( ژن CYP51A و MDR1) CT = (نمونه تیمار شده) ΔCT فرمول 2 (ژن بتا-اکتین) CT-(ژن CYP51A و MDR1) CT= (نمونه تیمارنشده) ΔCT فرمول 3 (نمونه تیمارنشده ) ΔCT - (نمونه تیمار شده ) ΔCT = ΔΔCT در پایان مقدار نرمال شده بیان ژن هدف از فرمول زیر محاسبه می گردد : فرمول 4 بیان نرمال شده ژن تمام تست ها حداقل با 3 بار تکرار (triplicate) انجام خواهد گرفت. نهایتا با استفاده از نرم افزار Excel نمودارها رسم و جهت مقایسه بیان ژنها قبل و بعد درگیری با دارو از تست Mann–Whitney U test / Wilcoxon استفاده خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 61861 |
| عنوان فارسی طرح | ارزیابی و مقایسه تاثیر وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول بر رشد و بیان ژنهای cyp51A و mdr1 در ایزولههای آسپرژیلوس فلاووس مقاوم به داروی وریکونازول با استفاده از تکنیک Real-time PCR |
| عنوان لاتین طرح | Evaluation and comparison of the effects of voriconazole and liposomal-voriconazole on the growth and cyp51A and mdr1 genes expression in voriconazole-resistant Aspergillus flavus isolates using Real-time PCR technique |
| نوع طرح | گرنت پژوهشی |
| اولویت طرح | توسعه فناوریهای نوین برای دارورسانی |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | خير |
| مقطع پایان نامه | |
| مدت اجرا - ماه | 24 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | گونههای مختلف جنس آسپرژیلوس قارچهای رشتهای با انتشار جهانی هستند. تا به امروز حدود 900 گونه از آسپرژیلوسها تعیین هویت شده است. که از این مجموعه تنها 20 گونه به عنوان پاتوژن انسانی هستند. اسپورهای آسپرژیلوس از طریق تنفس ایجاد کلونیزاسیون کرده و بسته به شرایط سیستم ایمنی میزبان حالات آلرژی یا عفونت مهاجم ایجاد میکنند(1و2). آسپرژیلوزیس مهاجم دومین عفونت قارچی تهاجمی در انسانها در امریکاست که بعد از کاندیدیازیس مطرح میباشد. آسپرژیلوزیس مهاجم در افراد با ایمنی سالم نادر بوده اما سبب درجات مهمی از بیماریزایی و مرگ و میر در بیماران با نقص سیستم ایمنی است(3). آسپرژیلوس فلاووس دومین عامل شایع آسپرژیلوس مهاجم (حدود 20%-15%) بعد از آسپرژیلوس فومیگاتوس است و پاتوژن غالب در کشورهایی با شرایط آب و هوایی خشک مثل خاورمیانه، آفریقا و آسیای جنوب شرقی می باشد که (80%-50%) عامل سینوزیت، کراتیت و عفونت های جلدی در انسان است (3). در دهههای اخیر درمان اولیه برای فرم آسپرژیلوزیس مهاجم وریکونازول میباشد، اما امروزه مقاومت دارویی نسبت به وریکونازول در آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس فومیگاتوس گزارش شده است که به دلیل افزایش روزافزون استفاده پروفیلاکتیک از وریکونازول به ویژه در مراکز پیوند است(1و3). داروهای ضد قارچی دارای جایگاه های هدف سلولی می باشند که با اثر بر روی آن ها موجب مرگ یا مهار رشد سلول قارچی میشوند. قارچ ها نیز توانائی مقابله با فعالیت مهاری این داروها را دارند و از طریق مکانیسمهای مختلفی نسبت به داروهای مختلف ضد قارچی مقاوم میشوند(4و5). مکانیسمهای شناخته شده سلولی و مولکولی که مسئول کاهش حساسیت به داروهای ضد قارچی چه در شرایط invivo و چه در شرایط invitro میشود به دو گروه تقسیم میشود :1.کاهش ذخیره داخل سلولی داروهای ضد قارچی در مقایسه با سلولهای حساس2. تغییر کمی یا ساختاری هدف داروهای ضد قارچی(6و7).کاهش ذخیره داخل سلولی دارو نیز به دو علت بوده : یا به علت انتشار به خارج دارو توسط efflux proteins یا به علت کاهش نفوذ پذیری دارو به داخل سلول به علت سد نفوذپذیری انتخابی دارو. دو گروه efflux proteins وجود دارد: 1.ATP binding cassette transporter (ABS) 2. Major facilitator superfamily(MFS)( 1و7). در بسیاری از مطالعات ارتباط مستقیمی را بین جهشهای نقطهای خاص در cyp51A و مقاومت آزولی در گونههای آسپرژیلوس، بویژه آسپرژیلوس فومیگاتوس نشان دادهاند. درآسپرژیلوس دو محدوده ژنی نزدیک و مرتبط به هم وجود دارد (cyp51A, cyp51B). مطالعات نشان دادهاست که cyp51A پیوند محکمتری را با ترکیبات آزولی نسبت به cyp51B ایجاد میکند که به طور معمول حساسیت بیشتری نسبت به ترکیبات آزولی دارد. Cyp51A کد کننده آنزیم α14 - دی متیلاز بوده که برای رشد قارچ ضروری میباشد (8و9). بر طبق مطالعات، ترکیبات آزولی میتوانند به مولکول آهن فعال در مرکز cyp51A باند شوند و عملکرد آنزیمی آن را مهار کنند. جابهجایی در اسیدهایآمینه در cyp51A در ایزولههای کلینیکی و آزمایشگاهی باعث ایجاد ایزولههای مقاوم آسپرژیلوس فومیگاتوس و آسپرژیلوس فلاووس به یک یا چند ترکیب آزولی شده است که البته تعدادی از آنها در ایزولههای حساس نیز یافت شدهاند. ذکر این نکته ضروری است که در بعضی از ایزولههای مقاوم به ترکیبات آزولی هیچ گونه جهش در ژن cyp51A یافت نشده است(13-10). میزان حلالیت وریکونازول در آب محدود است و از تنها فرمول تجاری موجود (VFEND® (voriconazole) که محتوی سولفوبوتیل اتر بتا سیکلوکودکسترین(SBECD) میباشد برای افزایش حلالیت آن در آب استفاده میشود. اثرات بالینی مشاهده شده این ترکیب نفروتوکسیتی ، همولیز، گرفتگی عروق و سمیت کلیوی و کبدی میباشد( 14). برای غلبه بر این مسائل استفاده از لیپوزومها بعنوان حامل وریکونازول مورد بررسی قرار گرفته است. لیپوزومها نسبتا غیرسمی و قابل تخریب هستند بنابراین، آنها طیف گستردهای از کاربردهای زیست پزشکی را دارند. اندازه کوچک نانوذرات لیپیدی، دسترسی آنها را به بافتها افزایش میدهد و میتوانند جایگزین مناسب در مقاومت به داروهای ضد قارچی معمول بویژه در عفونتهای قارچی تهاجمی از جمله آسپرژیلوزیس باشد( 14 ). ضرورت اجرا: آسپرژیلوس فلاووس عامل اتیولوژیک اغلب سینوزیتهای قارچی و آسپرژیلوزیس مهاجم در افراد با زمینه مستعد کننده و نیز افراد سالم به ویژه در ایران میباشد که موارد گزارش آن در کشور رو به افزایش بوده که توسط یافتههای هیستوپاتولوژیک نیز به اثبات رسیده است. از طرف دیگر با توجه به این که در تحقیقات انجام گرفته بر روی حساسیت دارویی ایزولههای آسپرژیلوس فلاووس جدا شده از بیماران، بعضی از ایزولهها مقاوم به وریکونازول شناخته شدند و با توجه به اینکه اخیرا اطلاعات مربوط به تعدادی از ژنهای مسئول در این مقاومت شناسایی شده اند ، لذا در این طرح برآن هستیم که با استفاده تاثیر لیپوزوم-وریکونازول بر رشد و بیان ژن های cyp51A و mdr1 در ایزولههای آسپرژیلوس فلاووس مقاوم به داروی وریکونازول ، بتوانیم راهکاری برای کنترل عفونت های قارچی در آینده ارائه طریق نمائیم. |
| اهداف اختصاصی | مقایسه میزان مهار رشد وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول بر روی آسپرژیلوس فلاووس -مقایسه تاثیر وریکونازول و لیپوزومال وریکونازول بر میزان بیان ژن های CYP51A و MDR1 در آسپرژیلوس فلاووس |
| چکیده انگلیسی طرح | |
| کلمات کلیدی | آسپرژیلوس فلاووس: قارچ هیالن هایفومایست، یکی از عوامل بیماری آسپرژیلوزیس وریکونازول: داروی ضدقارچی از گروه تریآزولها Real - Time PCR (Q-PCR): در این روش میتوان یک سکانس خاص را در DNAی هدف، جستجو و شناسایی کرد و همچنین مقدار آن را در نمونه های مورد مطالعه اندازهگیری نمود. در این تکنیک نیز اصول کلی PCR حاکم است ولی نکته حائز اهمیت این است که پس از تکثیر DNA در هر سیکل، غلظت دقیق آن اندازه گیری میشود. |
| ذینفعان نتایج طرح |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| صنم نامی | مجری اول (اصلی-هیات علمی) |
| حامد همیشه کار | همکار اصلی |
| بهزاد برادران | همکار اصلی |
| عادل اسپوتین | همکار اصلی |
| نوید شمالی | همکار اصلی |
| پرویز حسن پور | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر داروی لیپوزومال وریکونازول در درمان گونههای مقاوم آسپرژیلوس فلاووس اثرات مطلوبی داشت.متن خبر داروی خط اول درمان در آسپرژیلوزیس مهاجم با عامل اتیولوژیک آسپرژیلوس فلاووس، داروی وریکونازول است. در سالهای اخیر شاهد گونههای مقاوم به این دارو بوده که بدلیل افزایش بیان ژنهای Cyp51A و MDR1 در گونههاست. بنابراین امروزه محققان بدنبال راههایی برای بهینه سازی داروهای موثر در درمان گونههای مقاوم میباشند.در مطالعه حاضر با استفاده از فرمولاسیون جدیدی از داروی وریکونازول (لیپوزومال وریکونازول) شاهد نتایج مطلوبتری در گونه های مقاوم بوده که نیاز به مطالعات جامع تری در شرایط in vivo می باشد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
