بررسی اثرات ضد سرطانی متابولیت های ثانویه باکتری Streptomyces levis ABRIINW 111 بر روی رده سلولی SW480 )سرطان کولون(

مجریان: حجت اله نوزاد چروده

خلاصه روش اجرا: کشت استرپتومایسس لویس: استرپتومایسس لویس در انکوباتور شیکردار حاوی محیط کشتISP2 به مدت 7 تا 15روز کشت داده می شود. استخراج متابولیت های ثانویه: به منظور جداسازی متابولیت های ثانویه ، مقداری از باکتری های مورد نظر به محیط کشت مولر هینتون براث اضافه شده و در انکوباتور شیکر دار با دمای 29 درجه سانتی گراد و دور حرکت 125 rpm قرار می گیرد و 36 ساعت بعد میزان کدورت محیط کشت در طول موج 600 نانومتراندازه گیری می شود. در مرحله بعد 1 میلی لیتر از سوسپانسیون حاصل به ظرف جدید حاوی محیط مولر هینتون براث انتقال یافته و همانند مرحله اول در انکوباتور شیکر دار قرار می گیرد. پس از 36 ساعت تمامی محیط کشت در دور4000rpm به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ می گردد. رسوب (بیومس) حاصل دور ریخته و سوپرناتانت از کاغذ صافی شماره یک عبور داده می شود. فرآیند استخراج با استفاده از حلال آلی اتر انجام می گیرد. این حلال به نسبت 1:1 به مایع اضافه شده و به مدت 1 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجه سانتیگراد و دور حرکت 175rpm قرار گرفته و به شدت هم زده می شود. مخلوط حاصل به دکانتور انتقال یافته و فاز مایع از فاز حلال جدا می گردد. فاز حلال که حاوی متابولیت های ثانویه است در دمای 34 درجه سانتیگراد و در فشار پایین تغلیظ می شود. تهیه غلظت های مختلف متابولیت ها: حلال اتر را در دمای اتاق تبخیر می دهیم و به منظور تهیه غلظت های مختلف ، پودر حاصله را در حلال DMSO حل می کنیم و غلظت های مختلف از آن را (10 تا 5000 نانو گرم بر میلی لیتر) تهیه می کنیم. کشت سلول : رده سلولی سرطان کولون انسان SW480 از بانک سلولی انیستیتو پاستور ایران خریداری خواهد شد و در محیط کشت 0RPMI-164 که با سرم جنین گاوی(Fetal bovine serum) 10 درصد و آنتی بیوتیک های استرپتومایسین (100 میکروگرم بر میلی لیتر) و پنی سیلین (100 واحد بر میلی لیتر) غنی شده است، در دمای 37 درجه سانتیگراد ، رطوبت 95% و کربن دی اکسید 5 % کشت داده خواهد شد. تیمار سلول با متابولیت های ثانویه: پس از چندین بار پاساژ دادن، در مرحله رشد لگاریتمی ، سلول ها در پلیت های 96 خانه تقسیم خواهد شد. متابولیت های ثانویه در چندین غلظت (10 تا 5000 نانو گرم بر میلی لیتر) به سلول ها اضافه خواهد گردید و در فواصل زمانی 12,24,48,72 ساعت تیمار صورت خواهد گرفت. لازم به ذکر است که اکثر داروها در DMSO حل می شود و تیمار به گونه ای انجام می شود که درصد DMSO در محیط از 0.01% تجاوز نکند تا حلال اثرات جانبی نداشته باشد. روش های به کار گرفته جهت بررسی آپوپتوز : آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده یک نوع از مرگ سلولی می باشد . همانگونه که تقسیم سلولی و نقل و انتقال سلولی پراهمیت است مرگ برنامه ریزی شده به ارگانیسم اجازه می دهد تا به شدت تعداد سلول ها و سایز بافت را کنترل کند و از شر سلول هایی که هموستازی بدن را تهدید می کنند خلاص گردد. انتخاب مسیر مرگ یا بقا در درون سلول از جمله اتفاقات مهم در تنظیم سیستم ایمنی است. بقا سلول های جهش یافته منجر به ایجاد تومور های سلولی می شود که باعث به هم خوردن نظم سیستم ایمنی در سلول می شود. 1- بررسی سیتوتوکسیک بررسی سیتوتوکسیسیتی اولین گام در بررسی آپوپتوز است. با این روش میزان مرگ سلولی مورد ارزیابی قرار می گیرد. این روش قادر به تمایز آپوپتوز از نکروز نیست. با بررسی سیتوتوکسیسیتی درصد سلول های زنده یا مرده نسبت به گروه شاهد به دست می آید. در این مطالعه بررسی سیتوتوکسیسیتی با روش MTT صورت می گیرد. 2- تغییرات مورفولوژیک ارزیابی مورفولوژیکی نقش کلیدی در مطالعات مرگ سلولی دارد. برای بررسی تغییرات مورفولوژیکی سلول های آپوپتوزی نیاز به میکروسکوپ است( میکروسکوپ الکترونی ، نوری یا فلورسانس). در این مطالعه بررسی توسط میکروسکوپ نوری صورت می گیرد. با میکروسکوپ نوری می توان تراکم کروماتین و اجسام آپوپتوتیک در سلول های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین- ائوزین را مشاهده کرد. چنانچه هسته با پروپیدیوم آیودید(PI) رنگ آمیزی شود، می توان با فلوسایتومتری بررسی کرد. بررسی میزان تکثیر سلولی با استفاده از فلوسیتومتری Ki-67: آنتی ژن Ki-67 که با نام های Ki-67 و MKI67 شناخته می شود، پروتئین انسانی است که توسط ژن MKI67 کد می شود.Ki67 پروتئین هسته ای که برای تکثیر سلول مورد نیاز است و با rRNA در ارتباط است. غیر فعال شدن آنتی ژن Ki67 موجب مهار سنتز rRNA می شود. پروتئین Ki67 مارکر سلولی برای تکثیر سلولی است. در طی اینترفاز، آنتی ژن Ki67 درون هسته سلول قابل شناسایی است در حالیکه در طی میتوز بیشتر پروتئین به روی کروموزوم ها منتقل می شود. این پروتئین در تمام مراحل چرخه سلولی (G1,S,G2) وجود دارد اما در سلول های در حال استراحت (G0) وجود ندارد. Ki 67 مارکر بسیار مناسب جهت تعیین میزان رشد جمعیت سلولی است. بررسی فلوسیتومتری کاسپاز3 : کا سپاز ها اجریی ترین عضو آپوپتوز هستند، بصورت زیموژن در سلول حضور دارند و فعالیت پروتئازی دارند. شامل دو گروه کاسپاز های آغازگر و کاسپازهای عمل کننده یا افکتور می باشند.کاسپاز های آغازگر مانند کاسپاز 8 فعال شده و کاسپاز های افکتور مانند کاسپاز 3 را فعال می کنند، بدین ترتیب آیشار کاسپازی را به راه می اندازند.