اثر پروتئین-های استخراج شده از پرده آمنیون بر آسیب سلولی ناشی از هیپوکسی در رده سلولی H9c2

مجریان: محمد نوری

خلاصه روش اجرا: در این بررسی رده سلولی H9c2 مربوط به سلولهای کاردیومیوسیت جنین موشی از بانک سلولی انستیتو پاستور تهیه می¬شود. رده سلولی H9c2 را در فلاسک¬های کشت سلولی حاوی محیط کشت سلولی و سرم جنین گاوی دارای آنتی بیوتیک کشت و انکوبه می¬کنیم. پس از ست شدن کشت, تعداد معینی از سلول ها را در well های پلیت می ریزیم فلاسک ها پاساژ داده می شوند تا تعداد مورد نیاز سلول به دست آید. پس از گذشت Doubling time و رسیدن سلولها به رشد 70-80 درصدی سلول ها را جهت مطالعه و انجام امایشات مورد استفاده قرار می¬دهیم. پرده آمنیون نیز از زنانی که بصورت فول¬ترم یا سزارین کرده¬اند دریافت می¬شود و از نظر الودگی به هپاتیت و سفلیس و همچنین ایدز مورد بررسی قرار می¬گیرد. پرده آمنیون بعد از فراهم شدن هموژنیزه و در داخل یخ سونیکه خواهد شد (تکرار 4 بار به مدت 15 ثانیه). بعد از آن در دور rpm 15000 و به مدت 30 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شده و در نهایت پروتئین های محلول لایه رویی با استفاده از فیلتر0.22-m فیلتر و استریلیزه و جهت مطالعه استفاده خواهند شد. مقادیر پروتئین¬های استخراج شده از پرده آمنیون (AMP) به روش نانودراپ اندازه¬گیری می¬شود و تا زمان مطالعه در 80- نگهداری می¬گردد. در ابتدای کار انکوباسیون و بررسی اثرات پروتئین¬های استخراج شده بر روی رده سلولی H9C2با روش MTT و بدون ایجاد شرایط هیپوکسی و در حضور پروتئین های پرده آمنیون انجام خواهد گرفت. بر اساس مطالعات قبلی بر روی انواع رده های سلولی مقادیر پروتئین در مقیاس µg/mL و بصورت مقادیر 0، 12.5، 25، 50، 100، 200 انتخاب خواهد شد. سپس با توجه به نتایج بدست آمده از روش MTT مقادیر پروتئین مورد نظر جهت بررسی اثر پروتئین در شرایط هیپوکسی انتخاب خواهد شد. سلول¬ها را به گروه کنترل و تیمار تقسیم کرده و گروه تیمار را تحت شرایط هیپوکسی (1%O2) با پروتئین پرده آمنیون تیمار کرده بعد از سپری شدت مدت زمان 24 ساعت که سلول ها در شرایط هیپوکسی قرار دارند سلولها از وضعیت هیپوکسی خارج و در اقدام بعدی پروسه های بیوشیمی¬یایی و مولکولی جهت بررسی اهداف مورد نظر مورد استفاده قرار میدهیم. جهت بررسی اثر پروتئین¬های پرده آمنیون بر میزان بقا و تکثیر سلولی روش MTT مورد استفاده قرارخواهدگرفت. جهت مقایسه میزان بیان ژن های مورد نظر RNA توتال گروه تیمار و کنترل را استخراج کرده وcDNA آن با استفاده از آنزیم reverse transcriptase ساخته خواهد شد. سپس روی cDNA سنتز شده real time-PCR انجام خواهد گرفت. برای تعیین میزان اثر پروتئین¬های پرده آمنیون بر روی بیان ژن ¬های مورد نظر از روشReal Time PCR و بررسی بیان پروتئین به روش وسترن انجام خواهد گرفت. میزان تغییرات پتانسیل غشایی با استفاده از کیتTMER Mitochondrial Membrane Potential Assay مورد سنجش قرار خواهد گرفت. جهت بررسی آپوپتوز حاصل از تغییرات پتانسل غشایی بعد از تیمار با AMP از روشAnnexin V و پروپیدیوم یدید (PI) استفاده شده و با دستگاه فلوسیتومتری میزان سلولهای آپوپتوزی و نکروزی و سالم ارزیابی خواهد شد. از مطالعه فعالیت β-galactosidase با استفاده از کیت میزان پیری سلول مورد بررسی قرار خواهد گرفت