مدیریت ریزمحیط تومور به منظور کاهش محیط سرکوبگر ایمنی و افزایش پاسخ های ایمنی ضد تومور در مدل تجربی

مجریان: فرهاد جدیدی نیارق

خلاصه روش اجرا: هدف این مطالعه مدیریت ریزمحیط تومور است. بدین گونه که فاکتورهای مهاری و تکثیری HIF-1α و گیرنده EP4 با استفاده از نانوذرات بارگیری شده با siRNA و فاکتورهای CDK (Cyclin Dependent Kinases) با داروی مهارکننده CDKs (Dinaciclib) در مدل موشی سرطان سینه 4T1 مورد هدف قرار می گیرند تا بازوهای مهاری و تکثیری سلول های سرطانی بطور همزمان مورد تهاجم قرار گیرند. این مطالعه در دو فاز متوالی و مجزا به انجام خواهد رسید. فاز اول: تولید نانوذرات Spion کونژوگه شده با کیتوزان تیوله و پپتید بارگیری شده با مولکول های siRNA و بررسی ویژگی های فیزیکوشیمیایی آنها : ابتدا spion و کیتوزان تیوله را با هم مجاور می کنیم تا ترکیب spion –کایتوزان تیوله تولید شود و سپس با اضافه کردن پپتید واکنش بین گروه تیول پلی مر و گروه تیول انتهایی پپتید صورت می گیرد.نانوذرات spion توانایی بالایی برای کپسوله کردن siRNA و حفاظت از آن در برابر تخریب سرمی دارد.بعد از اینکه نانوذرات شکل گرفتند بارگذاری siRNA در نانوذرات با استفاده از واکنش polyelectrolyte complexation صورت می گیرد. تولید کمپلکس نانوذرات-siRNA با ژل اکتروفورز در ژل 2% آگارز تایید می شود و میزان بارگیریsiRNA به صورت کمی بوسیله روش اولتراسانتریفیوژ بررسی خواهد شد. ضمن اینکه ویژگی های فیزیکوشیمیایی نانوذرات نظیر اندازه، پتانسیل زتا و مقاومت در برابر سرم نیز بررسی خواهد شد. برای بررسی ورود نانوذرات به سلول از روش کونفوکال میکروسکوپی استفاده خواهد شد. علاوه بر این پایداری نانوذرات تشکیل شده در مقابل سرم و الگوی رهایش مولکول های siRNA نیز بررسی خواهد گشت. لازم به ذکر است که از رده سلولی سرطانی 4T1 (سرطان پستان) در این مطالعه استفاده خواهد شد. این رده سلولی در محیط RPMI1640حاوی 10%fetal bovine serum و آنتی بیوتیک کشت داده می شوند.پس از گذشت ۲۴ ساعت از کشت سلولی نانوذرات حاوی siRNA را به محیط کشت هر رده سلولی اضافه می کنیم. .میزان سمیت نانوذرات حاویsiRNA بر روی حیات سلولی نیز توسط آزمون MTT ارزیابی می شود. فاز دوم: در این فاز از مطالعه ترکیبات مختلف نانوذرات و داروی Dinaciclib برای درمان موش های مدل تومور سرطان سینه استفاده خواهند شد. حیوان مورد استفاده در این بررسی، موش ماده Balb/c 6 تا 8 هفته و وزن تقریبی 23-16 گرم از انستیتو پاستور تهران خریداری می شود و در شرایط استاندارد از نظر آب، غذا، نور، دما و محیط در حیوانخانه دانشکده پزشکی نگهداری می شوند. برای القای تومور و همچنین به منظور تشریح اندام های درونی، موش ها بیهوش خواهند شد. بدین منظور، هر کدام از موش ها با تزریق داخل صفاقی کتامین/ زایلازین (با دوز 60میلی گرم /کیلوگرم از وزن بدن کتامین و 10 میلی گرم/کیلوگرم زایلازین) بیهوش خواهند شد. لازم به ذکر است که در صورت ایجاد زخم در تومور موش ها بلافاصله از مطالعه خارج خواهند شد و اجازه رشد تومور با وجود زخم بیرونی که برای حیوان آزاردهنده خواهد بود داده نخواهد شد. همچنین در صورت رسیدن سایز تومور به اندازه 400 میلی متر مربع، بر اساس استانداردهای اخلاقی جهانی، آن موش از مطالعه خارج خواهد شد و اجازه رشد بیشتر تومور داده نخواهد شد. معدوم نمودن بهداشتی لاشه حیوانات با اهداف جلوگیری از شیوع احتمالی بیماریهای مشترک (زئونوز) و یا سایر بیماریهای مسری بین حیوانات ، دور نمودن لاشه از دسترس سایر حیوانات و افراد سودجو همچنین جلوگیری از آلوده شدن خاک ومنابع آبی (جاری وسفره های زیر زمینی) انجام می گیرد. دراین صورت باید به نحو ذیل اقدام گردد: 1- حتی الامکان از جابجایی زیاد لاشه خودداری گردد . 2- به هیچ وجه لاشه، باز ( کالبدگشایی ) نشود . 3- در صورت نیاز به جابجایی لاشه حیوان باید ضمن رعایت بهداشت فردی از وسایل ایمنی وحفاظت فردی استفاده گردد وضروری است لاشه در داخل ویا در روی کیسه پلاستیکی قرار گیرد وسپس جابجا شود تا از انتشار خونابه وسایر ترشحات آن جلوگیری گردد. 4- سوزاندن کامل لاشه بسیار مناسب است و در صورت کمبود امکانات بهترین گزینه بعدی دفن بهداشتی لاشه به همراه آهک یا آب آهک می باشد. جهت القای تومور در موشهای BALB/c از رده سلولی 4T1 (رده سلولی موشی سرطان سینه) استفاده می شود که از انستیتو پاستور ایران تهیه می گردد. رده سلولی توموری را در محیط RPMI حاوی اسیدآمینه های ضروری و گلوتامین کشت می دهیم. با تزریق این سلول ها به صورت زیرجلدی در حیوان مورد مطالعه تومور ایجاد می کنیم. با تزریق تعداد 7.5 * 105 سلول 4T1 به صورت زیرجلدی در حیوان مورد مطالعه تومور ایجاد می کنیم. لازم به ذکر است که دوز درمان ها ترتیب تزریق ها و تعداد تزریق ها با توجه مطالعات قبلی و بر اساس آزمودن و یافتن بهترین حالت انتخاب خواهد شد. پس از درمان، اندیکس های ایمونولوژیک متنوعی در موش های درمان شده و کنترل بررسی خواهند شد. از جمله این بررسی ها می توان به موارد زیر اشاره نمود: 1. بررسی فراوانی سلول های ایمنی نظیر سلول های Treg، Th17،K و MDSC در بافت تومور و طحال با روش فلوسایتومتری 2 . بررسی بیان مولکول های موثر در آنژیوژنز و متاستاز در محیط تومور به روش Real-time PCR 3. آنالیز تاثیر درمان بر روی سایز تومور و بقای موش ها نیز انجام خواهد شد.