تاثیر نیترات غیرارگانیک بر پارامترهای اسپرماتوزوئید، بیان میکروریبونوکلئیک اسیدهای 34b و449a ، آپوپتوز و تغییرات بافتی و استریولوژیک در بیضه رت های نر دیابتیک نوع 1 (تسویه حساب و گزارش نهایی)

مجریان: رعنا کیهان منش , محمدرضا علیپور

خلاصه روش اجرا: دیابت ملیتوس که به عنوان یک اختلال متابولیک شناخته شده است؛ تهدید بزرگی برای سلامتی جامعه بشری می باشد(1) و می تواند منجر به القاء اختلال عملکرد و نارسایی ارگان های مختلف از جمله رتینوپاتی (2)، نفروپاتی (3)، نوروپاتی محیطی (4) و نوروپاتی سیستم اتونوم منجر شونده به اختلالات معده ای-روده ای(5)، قلبی(6)، ادراری تناسلی(7) و جنسی(8) شود. از قرن 11 محققان در تلاش برای یافتن ارتباطاتی بین دیابت و ناباروری مردانه بوده اند(9). گزارشات اخیر نشان دهنده ی افزایش مداوم در تعداد بیماران جوان مبتلا به دیابت می باشد؛ و این افزایش وقوع بیماری در میان افراد جوان از این نظر که ممکن است بر اکثر افراد در سن فعال تولیدمثلی شان اثر گذارد نگران کننده است(10,11). اهمیت این موضوع توسط مطالعات اخیر صورت گرفته؛ که حاکی از ارتباط نزدیک بین وقوع افزایش یافته ی دیابت با کاهش میزان توالد و باروری در جوامع مدرن همراه است، آشکار می شود(12). البته تعداد زیادی از مطالعات در مردان دیابتی و مدل های حیوانی دیابت نشان داده اند که دیابت از طریق عمل در سطوح مختلف از جمله تغییر در اسپرماتوژنز، تغییرات آپوپتیک و دژنراتیو در بیضه ها، متابولیسم تغییر یافته ی گلوکز در سد خونی بیضه ای، کاهش ساخت و ترشح تستوسترون، اختلال عملکرد انزالی و میل جنسی کاهش یافته منجر به ناباروری مردانه می شود(20-13). ناباروری به عدم بارداری پس از حداقل 12 ماه مقاربت بدون جلوگیری اطلاق می شود و اخیرا شیوع بالایی(51%) از ناباروری در میان بیماران مبتلا به دیابت گزارش شده است(21). طبق مطالعات انجام یافته عوارض تولیدمثلی دیابت ممکن است به علت سیگنالینگ غیرنرمال انسولین در بیضه، اثرات سیستمیک انسولین، و یا ناشی از سطوح افزایش یافته ی گلوکز خون باشد(24-22). بیان شده است که انسولین محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-گنادال را تنظیم می کند(25)، با وجود این داده های بحث انگیزی (متضادی) در مورد عملکرد آن بر محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-گنادال منتشر شده است(29-26). براساس بررسی های انجام گرفته حضور انسولین در مغز انسان، رت، موش، قورباغه و لاک پشت(30) و همین طور توزیع وسیع گیرنده های انسولین در سیستم عصبی مرکزی مشخص شده است(31). مطالعه مغز انسان پس از مرگ و در رت ها نشان داده است که غلظت انسولین و C پپتید در مغز بسیار بیشتر از سطوح خونی آن می باشد که این ها پیشنهاد کننده تولید انسولین در مغز می باشند(32,33). در سیستم عصبی مرکزی بالاترین غلظت انسولین و C پپتید در هیپوتالاموس یافت شده است(32, 34) بعلاوه، هیپوتالاموس یک ناحیه ی بسیار نفوذپذیر نسبت به انسولین است(34) و انسولین به طور مستقیم در هیپوتالاموس عمل کرده و از طریق سلول های حاوی گیرنده ی انسولین مانند نورون های کیس پپتین، AGRP، POMC، NPY و KNDY بر تحریک پذیری نورون های GnRH اثر می گذارد(37-35). هم چنین نشان داده شده است که انسولین نقش مرکزی در تنظیم ترشح گنادوتروپین های هیپوفیزی ایفا می کند(38) که بر این اساس در افراد دیابتی به دلیل نبود یا کمبود انسولین پاسخ هیپوفیز به GnRH کاهش یافته و در نتیجه ترشح LH و FSH از هیپوفیز نیز کاهش خواهد یافت(16). بدین منظور برخی از مطالعات انجام یافته در مورد اثرات انسولین درمانی به هدف تنظیم ترشح LH و FSH نتایج متناقضی را از بهبودی کامل ترشح LH و FSH (26, 39) تا عدم بهبودی ترشح LH و FSH نشان می دهند(29, 40)؛ که این ناتوانی انسولین در برگرداندن ترشح LH و FSH ممکن است ناشی از کاهش بیان گیرنده های مغزی انسولین در دیابت باشد(41). تنظیم عملکرد بیضه ای ناشی از مکانیسم های متعددی است که شامل اثرات ترکیبی گلوکز، انسولین، LH و FSH می باشد(22) . مشخص شده است که انسولین در مراحل اولیه توسعه بیضه به عنوان مدولاتور ژن های خاص همچون Sry و Sox9 که برای تعیین جنسیت مردانه ضروری اند عمل می کنند(42)؛ بعلاوه انسولین پس از تولد در بیضه سبب تنظیم تکثیر و شکل گیری سلول های زایا قبل و بعد از بلوغ می شود و بر اندازه ی بیضه اثر می گذارد(43). آنالیز ایمونوهیستوشیمیایی گیرنده انسولین بیضه ای در رت های سالم نشان دهنده یک سیگنال خاص مربوط به انسولین در همه انواع سلولهای بیضه ای بوده است و در دیابت کاهش اندک در بیان گیرنده انسولین در بافت بینابینی بیضه( سلول های لیدیگ) نسبت به بقیه محسوس بوده است(23). علاوه بر این انسولین در سطح بیضه در تکثیر و متابولیسم سلول های لیدیگ، حفظ گیرنده های LH روی سلول های لیدیگ و حفظ اسپرماتوژنز نقش ضروری دارد(22, 44). به سبب این اثرات وسیع انسولین بر روی بیضه؛ در دیابت القاء شده با STZ به دلیل فقدان انسولین شاهد کاهش تعداد و اختلال در فعالیت سلول های لیدیگ، کاهش تستوسترون، تخریب فرآیند اسپرماتوژنز، کاهش تعداد و حرکت اسپرم، کاهش ذخیره ی اسپرم اپیدیدمال و حجم مایع سمینال خواهیم بود(14, 45)؛ در حالی که افزودن انسولین به محیط کشت سلول های لیدیگ منجر به تنظیم تکثیر سلول های لیدیگ و متابولیسم لیپید در این سلول ها می شود(46). اخیرا مشخص شده است که بیضه یک منشاء خارج پانکراسی انسولین می باشد و دیابت القاء شده با STZ کاهش بیان انسولین بیضه ای را نشان می دهد(47)؛ با وجود این انسولین تولید شده در بیضه ممکن است برای باروری ضروری نباشد(24) و احتمالا انسولین پانکراسی می تواند به صورت غیر مستقیم و با اثرگذاری در سطح هیپوتالاموس بر عملکرد بیضه ای اثر کند (48). از طرف دیگر شرایط هیپرگلیسمی شدید در دیابت نیز بر عملکرد محور هیپوتالاموسی-هیپوفیزی-بیضه ای اثر می گذارد. نشان داده شده است که نورون های GnRH به عنوان حس گر مستقیم گلوکز عمل می کنند و گلوکز یک تنظیم کننده متابولیک کلیدی محور تولید مثلی است که توانایی تنظیم دقیق آزادی پالسی GnRH را دارد و هیپرگلیسمی با تخریب آزادی GnRH / گونادوتروپین همراه است(49). در شرایط هیپرگلیسمیک گلوکز دچار اکسیداسیون شده و منجر به افزایش سطح استرس اکسیداتیو و کاهش سطح آنتی اکسیدان ها در سلول های لیدیگ شده(50,51) و از طرف دیگر استرس اکسیداتیو افزایش یافته منجر به تخریب STAR می شود و در نهایت نتیجه این ها کاهش تولید و ترشح تستوسترون خواهد بود(52). ترشح کاهش یافته تستوسترون سبب کاهش در تعداد سلول های اسپرماتوژنیک خواهد شد(53). از این رو کنترل قند خون نقش مهمی در بهبود عوارض ناشی از دیابت خواهد داشت. مطالعات بافت بیضه در دیابت بیانگر تغییرات فوق ساختاری اعم از کاهش وزن و حجم بیضه، ضخیم شدن دیواره ها، کپسول و کاهش قطر و ارتفاع بافت پوششی زایا در توبول های سمینیفر، افزایش قطرات چربی و واکوئل ها در سلول های لیدیگ، ضخیم شدن دیواره عروق، مویرگ ها و آرتریول های ناحیه بینابینی، افزایش حجم ماتریکس بینابینی و کاهش در تعداد و ترشح سلول های لیدیگ می باشد(22). دو مکانیسم مشابه که منجر به تغییرات ناشی از دیابت در سلول های لیدیگ می شود شامل اثر هیپوانسولینمی روی سطوح LH و اثرات ترکیبی سطوح کاهش یافته ی LH و انسولین روی سلول های لیدیگ می باشد(23). مطالعات پیشین حاکی از مسیر نیتریک اکساید سنتاز(NOS) تخریب شده در دیابت ملیتوس می باشند(54). در دیابت هیپرگلیسمی که یک فاکتور تعیین کننده اصلی در سطوح NO سرم است(55)، می تواند استرس اکسیداتیو داخل سلولی را از طریق مکانیسم های متعددی افزایش دهد که منجر به تخریب فعالیت آنزیم دی متیل آرژنین دی متیل آمینو هیدرولاز( آنزیم درگیر در کلیرانس دی متیل آرژنین نامتقارن) می شود که با تخریب این آنزیم دی متیل آرژنین نامتقارن (مهارکننده رقابتی اندوژن NOS ) در بدن افزایش می یابد و به طور قابل توجهی فعالیت NOS را مهار می کند که نتیجه آن مهار سنتز NO منتج از اندوتلیوم عروق می باشد(54). نیتریک اکساید برای عملکرد مناسب اندوتلیال به منظور حفظ یک سیستم عروقی سالم ضروری است و اختلال عملکرد اندوتلیال یک نقش کلیدی در توسعه و پیشرفت عوارض دیابتی دارد(54). با وجود این نشان داده شده است که در 5 سال ابتدای ابتلا به دیابت میزان تولید NO می تواند احتمالا از طریق القاء بیان ژن eNOS و iNOS افزایش یابد(56,57) و این NO افزایش یافته در شرایط In vivo می تواند بسته به غلظت NO افزایش یافته دارای هر دو اثر سودمند و آسیب رسان باشد(56). در واقع مطالعات In vitro نشان می دهند که در معرض قرارگیری با گلوکز بالا در مراحل اولیه تولید NO را افزایش می دهد اما متعاقبا پس از در معرض قرارگیری برای یک مدت طولانی کاهش می دهد (56). نیتریک اکساید که توسط عمل NOS از L آرژنین سنتز می شود، یک تنظیم کننده ضروری هومئوستاز عروقی، عملکرد اندوکرین، سیستم ایمنی و انتقال دهنده ی عصبی می باشد (58). به دلیل این که نورون ها، عروق خونی و سلول های سیستم ایمنی بخش های جدایی ناپذیر سیستم تولید مثلی می باشند و با این دیدگاه که NO نقش عملکردی مهمی در آن سیستم ها ایفا می کند، این احتمال وجود دارد که NO یک تنظیم کننده مهم بیولوژی و فیزیولوژی سیستم تولیدمثلی باشد(59). مطالعات پیشین نشان داده است که NOS در بیضه، اپیدیدم، پروستات، اسپرم و سمینال وزیکول های رت و انسان بیان می شود(60) و حدود 46 سال قبل بیان شد که NO نقش حیاتی در تنظیم تولیدمثل در همه ی سطوح از مغز تا گنادها ایفا می کند(61) و عملکرد هیپوتالاموس-هیپوفیز-گناد را کنترل می کند، به طوری که تعداد زیادی از نورون های رها کننده NO در هیپوتالاموس یافت شده و NO در این ناحیه منجر به آزادی GnRH می شود (59) و در سطح هیپوفیز که NOS در گنادوتروف ها لوکالیزه شده است NO احتمالا از طریق فعال سازی گوانیلیل سیکلاز باعث آزادی عمدتا LH و اندکی FSHمی شود(59). کاهش میزان NO در دسترس در دیابت می تواند منجر به توسعه عوارض آترواسکلروتیک و وازوکانستریکشن (55) و حتی انسداد کامل عروقی در مراحل نهایی دیابت شود(56). این اختلالات سبب میکروآنژیوپاتی منجر شونده به هیپوکسی اندونوریال و دمیلیناسیون و در نهایت ایسکمی عصبی می شوند؛ سپس نوروپاتی محیطی توسعه می یابد(62). حدود 2/61 % افراد مبتلا به دیابت با عدم توانایی جنسی، شواهدی از نوروپاتی را نشان می دهند. نوروپاتی عصب خلفی پنیس که در پاسخ نعوظی دخیل است سبب می شود سرعت هدایت در آن به طور قابل توجهی کاهش یابد(62). نیتریک اکساید به عنوان نوروترنسمیتر اصلی در ایجاد شلی عضله صاف کاورنوس آلت تناسلی نقش ایفا می کند و این شلی عضله صاف جریان خون شریانی را افزایش داده و منجر به ایجاد نعوظ می شود که این فرایند در شرایط دیابتی به دلیل تخریب شلی وابسته به عضله صاف و کاهش NOS در بافت کاورنوزال دچار اختلال می شود(62). حضور NOS در شبکه ی عصبی در ادونتیس و اندوتلیوم شریان های مشروب کننده ی ارگان های جنسی نشان می دهد که NO، وازواکتیویتی و بنابراین عرضه خون به این ارگان ها را تنظیم می کند(63). حضور NOS در فیبرهای عصبی، ساختمان عضلانی و شبکه عصبی در نواحی ساب اپیتلیال و یا لامینا پروپریا پیشنهاد می کند که NO ممکن است قدرت انقباضی ارگان های تولیدمثلی را واسطه گری کند(64). هم چنین وجود NOS در اندوتلیوم عروقی در بیضه بیان می کند که ممکن است NO بر پرفوزیون بیضه و متعاقبا تحویل گنادوتروپین ها به سلول های لیدیگ و همچنین انتقال آندروژن از بیضه اثر گذارد(65). در مجموع این داده ها نشان می دهند که عملکرد سلول های لیدیگ توسط عروق بیضه ای تنظیم می گردد(65). در سال 1994 لاندربرگ و همکارانش گزارش کردند که NO علاوه بر مسیر کلاسیک که از L-آرژنین تولید می شود، در مسیری جدید از نیترات و نیتریت هم تولید می شود. این گزارش باعث تردید در ایده ی قدیمی مبنی بر مضر بودن نیترات و نیتریت شد و هم اکنون مشخص شده است که این مواد به عنوان سیستم پشتیبان برای تولید موثر NO در بدن به خصوص در زمان های کاهش NO عمل می کنند(70-66). اگر چه گزارش هایی مبنی بر بروز هیپرگلیسمی و دیابت نوع یک در دوزهای بالای مصرف نیترات وجود دارد(72و71)؛ اما نقش مفید درمان با نیترات و نیتریت در کاهش فشار خون، کاهش استرس اکسیداتیو، کاهش مصرف اکسیژن در زمان ورزش و کاهش چربی خون در موش هایی که فاقد ژن eNOS بودند نشان داده شده است(73و68) درمان با نیترات سدیم با دوز کم(100 میلی گرم در لیتر) موجب جلوگیری از افزایش گلوکز خون و فشار خون، بهبود تحمل گلوکز و بهبود اختلال لیپیدی در مدل حیوانی مبتلا به هایپرگلیسمی می شود(18). لوکالیزاسیون ویژه eNOS روی اسپرم پیشنهاد کننده ی درگیری NO در فیزیولوژی اسپرم می باشد(74). نشان داده شده است که NO تحرک اسپرم را تنظیم می کند(75)، گرچه غلظت های بالای NO تحرک اسپرم را کاهش می دهد(76)، غلظت های کم NO تحرک اسپرم را تقویت می کند(75). اثرات متضاد NO روی تحرک اسپرم مثال خوبی از اثرات غلظت های مختلف NO روی سیستم بیولوژیکی است. علاوه بر نقش NO در محور تولیدمثلی، نقش آن در ترشح انسولین نیز حائز اهمیت است، به گونه ای که بیان شده است که میکروسیرکولاسیون سلول های β به طور زیادی به NO حساس است(77). نشان داده شده است که نیتریت و نیترات و NO از طریق مسیرهای متفاوتی ازجمله افزایش جریان خون جزایر پانکراس، عملکرد میتوکندریایی، گلوکونئوژنز، برداشت گلوکز، تنظیم استرس اکسیداتیو و التهاب و ترشح انسولین بر هومئوستاز انسولین-گلوکز اثر می گذارد(58) و به سبب دارا بودن اثرات ضدالتهابی و آنتی اکسیداتیو؛ عوامل التهابی و اکسیداتیو افزایش یافته در دیابت را تقلیل می دهد(58). میکروریبونوکلئیک ها (miRNA) RNAهای کوچک غیر قابل کد شدن هستند که از طریق مورد هدف قرار دادن رونوشت های کد کننده پروتئین، در تقریبا تمام فرایندهای توسعه و پاتولوژیک در حیوانات نقش دارند(78) و توسط دو پروتئینRNase III شامل Drosha و Dicerتولید و پردازش می شوند(78). نشان داده شده است که اختلال تنظیم miRNA ها با اکثر بیماری های انسان به ویژه سرطان و دیابت مرتبط است(79) و تاکنون درگیری بسیاری از آن ها در عوارض دیابتی از جمله رتینوپاتی، نفروپاتی، نوروپاتی و عوارض قلبی-عروقی و ریوی نشان داده شده است(81, 80). در حال حاضر مشخص شده است که هر miRNA دارای صدها ژن هدف می باشد بنابراین حتی اگر بیان یک miRNA تغییر یابد اثر بزرگی بر روی تنظیم ژن های هدف خواهد داشت(80). مطالعات پیشین بیانگر وجود دو نوع اصلی RNA های کوچک غیر قابل کد شدن عملکردی شامل miRNAs و piRNAs در بیضه می باشد(81). مطالعات انجام گرفته هم چنین حاکی از تغییرات بیان miRNAها در بافت بیضه ای یا سلول های تولیدمثلی بیماران نابارور می باشد(83,82) و برخی مطالعات نشان داده اند که miRNA ها نقش مهمی در اسپرماتوژنز پستانداران ایفا می کنند(85,84)؛ به طوری که حذف انتخابی Dicer در سلول های سرتولی منجر به کاهش 90% اندازه بیضه و ناباروری به علت غیاب کامل اسپرم و تخریب پیشرونده ی بیضه می شود(86). مطالعه ای که توسط Jie Lian و همکاران در سال 2009 صورت گرفت پروفایل بیانmiRNA ها در بیضه انسان را نشان داد(87). در این مطالعه نشان داده شد چندین miRNA از جمله miRNA449a و miRNA-34b به مقدار زیادی در بیضه انسان بیان می شوند(87). هم چنین این مطالعه نشان دهنده ی بیان تغییر یافته ی یک سری از miRNA ها در بیضه ی بیماران نابارور دچار آزواسپرمی غیرانسدادی و بیماران مبتلا به کانسر پروستات بود(87). میکروریبونوکلئیک 449a که به ویژه به مقدار زیادی در بیضه بیان می شود کاسپاز 2 و Bcl2 و هم چنین ژن های مربوط به آپوپتوز را تنظیم می کند(81). در حقیقت بیان شده است که افزایش miRNA449a در کاردیومیوسیت ها به نفع بقای سلول است؛ در حالی که کاهش آن منجر به القای آپوپتوز سلول ها می شود(88). دو عامل PDCD4 و PACS2اهداف مستقیم miRNA449a می باشند و PACS2 از طریق انتقال Bidبه داخل میتوکندری سبب القاء آپوپتوز می شود. MiRNA-449a از طریق سرکوب این دو مولکول هدف به ترتیب منجر به مهار بیان و انتقال Bid به داخل میتوکندری می شود(88, 81). نشان داده شده است که در سلول های β جزایر دچار نقص PDCD4 سطح mRNA ژن های پروآپوپتیک (Bad ,Bax و Bid) کاهش یافته ولی در عوض سطح mRNA ژن آنتی آپوپتیک Bcl-xl افزایش می یابد(89). نشان داده شده است که اعضای خانواده ی miRNA-34 از طریق پروتئین سرکوبگر تومور p53، تنظیم کننده تکثیر و آپوپتوز می باشند(91,90). هم چنین نقش های مهمی در اسپرماتوژنز، تمایز سلول بنیادی، توسعه ی عصبی، پیری و عملکردهای قلبی-عروقی ایفا می کنند (91). فاکتور P53، فاکتور رونویسی می باشد که در پاسخ به آسیب DNA یا دیگر انواع استرس سلولی فعال می شود و هر دو ژن miR34 (miR34a و miR34b/c) حاوی چندین عنصر پاسخگو (response element) می باشد که p53 با اتصال به این نواحی موجب فعال سازی رونویسی و بیان miRNA-34b می شود(90). میکروریبونوکلئیک اسید 34b افزایش یافته منجر به کاهش میزان تکثیر و افزایش آپوپتوز سلول های زایای نر می شود(91) . علی رغم این که اندک مطالعاتی در مورد تغییرات بیان miRNA های بیضه در ناباروری صورت گرفته است اما تاکنون مطالعه ای در زمینه تغییرات بیان miRNA ها در ارگان های تولید مثلی افراد دیابتی انجام نشده است. از آنجائی که تغییرات بیان miRNAs بیشتر ناشی از عوامل استرسی همچون افزایش ROS ها و عوامل التهابی می باشد (91,90) و در دیابت در اثر هیپرگلیسمی تولید ROS ها و عوامل التهابی افزایش می یابد می توان فرض کرد که احتمالا بیان این miRNA ها در شرایط دیابتی در بیضه دچار تغییر خواهد شد. به دلیل این که آپوپتوز سلول های زایا نقش بسیار مهمی در ناباروری مردانه ایفا می کنند و هر دو miR34b و miR449a نقش مهمی در آپوپتوز دارند تغییرات بیان این دو میکروریبونوکلوئیک اسید می تواند نقش مهمی در القاء آپوپتوز سلول های زایای نر و در نتیجه ایجاد ناباروری ایفا کند(90,81(