تاثیر قطعه نوترکیب Hcc زنجیره سنگین توکسین کزاز بر روی لنفوسیت های T خالص شده انسانی به عنوان کاندیدی برای واکسیناسیون
The effect of recombinant tetanus toxin Hcc fragment (rHcc) on purified human T cells as a new vaccine candidate
مجریان: مهدی یوسفی
خلاصه روش اجرا: برای جداسازی سلولهای T با کمک ذرات نانو مغناطیسی از افراد داوطلب سالم، پس از اخذ رضایت نامه خونگیری شده و با استفاده از فایکول 1.077 سلولهای تک هسته ای خون (PBMCs) جداسازی می شوند. لنفوسیت های T با استفاده از Nanobead های پوشیده شده از آنتی بادیهای مونوکلونال ضد CD8، CD14، CD15، CD16، CD19، CD36، CD56، CD123 وCD235a ساخت شرکت Milteny Biotec به روش انتخاب منفی (Negative Selection) جدا و غنی سازی می شوند. سپس لنفوسیت های T با غلظت های مختلف Hcc (2-20 µg/ml) (2) در حضور آنتی بادی های مهاری TLR2 در محیط کشت حاویRPMI1640 و FBS 10% و در زمان های مختلف 24-48) ساعت( در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5% CO2 کشت داده شده و سپس از نظر بیان ژنهای سایتوکاین ها قرار می گیرند. به منظور بررسی میزان بیانmRNA IFNγ ، IL-2 و TNFα (به عنوان شاخص Th1) در سلول های T، RNA کل سلولها (Total RNA) توسط معرف TRIZOL استخراج شده و سپس روش QRT- PCR انجام می گردد. در این روش کمی، میزان نسخه های mRNA ژن های سایتوکاین های مزبور و β-اکتین (بعنوان کنترل داخلی)، بر اساس میزان فلورسانت تولید شده اندازه گیری می شود که در آن از رنگ اینترکاله شونده با DNA دو رشته ای (SYBR Green) استفاده شده و میزان بیان ژن به صورت کمی اندازه گیری می شود. میزان ترشح سایتوکاین هایIFN-γ و TNF-α در مایع رویی کشت سلولی، مطابق پروتکل به روش ساندویچ ELISA با کیت الیزا (R&D) انجام خواهد شد. همچنین بیان مارکرهای فعالیت سلولهای T، پس از تحریک با Hcc ، با استفاده از روش فلوسایتومتری و آنتی بادی های نشاندار شده با مواد فلوروکروم بر ضد CD3،CD69 ارزیابی می شود.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا در دانشکده/مرکز |
| کد طرح | 60671 |
| عنوان فارسی طرح | تاثیر قطعه نوترکیب Hcc زنجیره سنگین توکسین کزاز بر روی لنفوسیت های T خالص شده انسانی به عنوان کاندیدی برای واکسیناسیون |
| عنوان لاتین طرح | The effect of recombinant tetanus toxin Hcc fragment (rHcc) on purified human T cells as a new vaccine candidate |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | آنتی بادی های مونوکلونال و پروتئین های نوترکیب (از نظر: الف- جنبه های تولیدی و 2- پروتکل های درمانی) |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | کارشناسی ارشد |
| مدت اجرا - ماه | 12 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | کزاز (Tetanus) یک بیماری قابل پیشگیری می باشد که در سراسر جهان قابل شیوع است. این بیماری از طریق نوروتوکسین کزاز (TeNT) انتقال می یابد. TeNT به عنوان پلی پپتید منفرد تولید می شود )تقریبا150kDa ( و سپس به هولوتوکسین دوزنجیره ای فعال شکسته می شود: که در ان زنجیره سبک (light chain) (50kDa) و زنجیره سنگین (heavy chain) (100kDa) با یک باند دی سولفید منفرد به هم متصل شده اند. فراگمنت C بخش انتهای کربوکسیلی زنجیره سنگین توکسین کزاز می باشد که دارای ساب دومنی به نام Hcc می باشد. این ساب دومن محل اصلی اتصال نوروتوکسین کزاز به گیرنده های گانگلیوزیدی بوده و بسیار ایمونوژن می باشد. مطالعات اخیر نشان می دهد Hcc می تواند سیستم ایمنی میزبان را تحت تاثیر قرار داده موجب تولید آنتی بادی های خنثی کننده و نیز تحریک لنفوسیت های T علیه توکسین کزاز شود و در امر واکسیناسیون مورد توجه قرار گیرد. از آنجایی که یکی از مسیر های مهم فعال سازی سیستم ایمنی توسط مولکول هایی چون Hcc از طریق فعال کردن رسپتور های شبه تول (Toll like receptors) به ویژه TLR2 می باشد، در این طرح برای بررسی پاسخ های لنفوسیت های T بر علیه توکسین کزاز اهداف زیر تعیین گردیده است: (1جداسازی لنفوسیت های T با استفاده از نانو ذرات مغناطیسی (2 کشت لنفوسیت های T خالص شده با غلظت های مختلف Hcc در حضور آنتی بادی های مهارکننده TLR2 (3 ارزیابی سطح mRNA سایتوکاین های مختلف تولید شده توسط لنفوسیت های T با روش Quantitative RT-PCR (4سنجش سایتوکاین های ترشح شده توسط لنفوسیت های T با روش ELISA (5بررسی مارکرهای فعالیت لنفوسیت های T با روش Flow Cytometry |
| اهداف اختصاصی | |
| چکیده انگلیسی طرح | To isolate T cells with the help of magnetic nanoparticles from healthy volunteers, blood is collected after obtaining informed consent and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated using Ficoll 1.077. T lymphocytes are isolated and enriched using Nanobeads coated with monoclonal antibodies against CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123 and CD235a manufactured by Milteny Biotec using the negative selection method. Then, T lymphocytes were cultured with different concentrations of Hcc (2-20 µg/ml) (2) in the presence of TLR2 inhibitory antibodies in a culture medium containing RPMI1640 and 10% FBS for different times (24-48 hours) at 37°C and 5% CO2 and then subjected to cytokine gene expression. In order to examine the expression level of IFNγ, IL-2 and TNFα mRNA (as a Th1 indicator) in T cells, total RNA was extracted using TRIZOL reagent and then QRT-PCR was performed. In this quantitative method, the mRNA copies of the cytokines and β-actin (as an internal control) were measured based on the amount of fluorescence produced, in which a double-stranded DNA intercalating dye (SYBR Green) was used and the gene expression level was measured quantitatively. The secretion level of IFN-γ and TNF-α cytokines in Cell culture supernatant will be analyzed according to the protocol using the sandwich ELISA method with the ELISA kit (R&D). Also, the expression of T cell activity markers, after stimulation with Hcc, will be evaluated using flow cytometry and fluorochrome-labeled antibodies against CD3, CD69. |
| کلمات کلیدی | TeNT: نوروتوکسین کزاز جزء خانواده نوروتوکسین های کلسترودیال می باشد که مسئول سندرم های فلج عصبی است که ابتدا به صورت یک زنجیره پلی پپتید منفرد تولید می شود و سپس به هولوتوکسین فعال شامل دو زنجیره سبک (Light chain) و زنجیره سنگین (Heavy chain) تبدیل می شود. Hcc : ساب دومن نوترکیب زنجیره سنگین فراگمنت C توکسین کزاز میباشد که با وزن مولکولی 25 KDa در اتصال نوروتوکسین کزاز به گانگلیوزید های عصبی نقش دارد. |
| ذینفعان نتایج طرح |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| مهدی یوسفی | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| سعیده ترابی گودرزی | دانشجوی مالک پایان نامه |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر قطعه نوترکیب زنجیره سنگین توکسین کزاز (Hcc) به عنوان کاندیدی برای واکسیناسیون است.متن خبر کزاز(Tetanus) یک بیماری قابل پیشگیری می باشد که در سراسر جها ن قابل شیوع است و عمدتا در کشورهای در حال توسعه و در میان نوزادان مرگ و میر بالایی را به همراه دارد. آنتی بیوتیک ها، آنتی توکسین ها، ایمونوگلوبولین ها و مراقبت از زخم های ایجاد شده از روش های کنترل این بیماری می باشد. زنجیره سنگین توکسین کزاز (Hcc) می تواند سیستم ایمنی میزبان را تحت تاثیر قرار داده موجب تولید آنتی بادی های خنثی کننده و نیز تحریک لنفوسیت های T علیه توکسین کزاز شود و در امر واکسیناسیون مورد توجه قرار گیرد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که میزان بیان فاکتور نسخه برداری مرتبط با سلول های Th1 و سایتوکاین مرتبط با آنها در حضور قطعه نوترکیب زنجیره سنگین توکسین کزاز به طور معنی داری افزایش می یابد که بیانگر این مطلب است که تحریک سلول های T با قطعه نوترکیب زنجیره سنگین توکسین کزاز منجر به تحریک تولید آنتی بادی محافظتی علیه توکسین کزاز می گردد. |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر میزان بیان فاکتور نسخه برداری T-betو سایتوکاین IFN-γ و سطح ترشحی این سایتوکاین در حضور قطعه نوترکیب زنجیره سنگین توکسین کزاز افزایش یافت.متن خبر زنجیره سنگین توکسین کزاز (Hcc) می تواند سیستم ایمنی میزبان را تحت تاثیر قرار داده موجب تولید آنتی بادی های خنثی کننده و نیز تحریک لنفوسیت های T علیه توکسین کزاز شود.در این مطالعه ابتدا از افراد داوطلب سالم، خونگیری به عمل آمده و با استفاده از فایکول سلولهای تک هسته ای خون جداسازی شدند. در ادامه سلولهای T با کمک ذرات نانو مغناطیسی جداسازی و غنی سازی شد. سپس لنفوسیت های T با غلظت های مختلف Hcc در حضور آنتی بادی های مهاری TLR2 در محیط کشت و در زمان های مختلف 24-48 ساعت کشت داده شده و سپس از نظر بیان ژنهای سایتوکاین ها و فاکتورهای نسخه برداری مورد بررسی قرار گرفتند. میزان ترشح سایتوکاین های IFN-γ در مایع رویی کشت سلولی، مطابق پروتکل با کیت الیزا بررسی شد. مطالعه ما نشان داد که میزان بیان فاکتور نسخه برداری T-bet و میزان بیان و نیز سطوح ترشحی سایتوکاین IFN-γ بعد از 48 ساعت در حضور قطعه نوترکیب زنجیره سنگین توکسین کزاز به طور معنی داری افزایش یافت. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر میزان بیان و سطوح ترشحی سایتوکاین های IL-4 و IL-17 در حضور قطعه نوترکیب زنجیره سنگین توکسین کزاز تغییر نمی کند.متن خبر کزاز(Tetanus) یک بیماری قابل پیشگیری می باشد که عمدتا در کشورهای در حال توسعه و در میان نوزادان مرگ و میر بالایی را به همراه دارد. زنجیره سنگین توکسین کزاز (Hcc) می تواند سیستم ایمنی میزبان را تحت تاثیر قرار داده و در امر واکسیناسیون مورد توجه قرار گیرد. در این مطالعه ابتدا از افراد داوطلب سالم، خونگیری به عمل آمده و با استفاده از فایکول سلولهای تک هسته ای خون جداسازی شدند. در ادامه سلولهای T با کمک ذرات نانو مغناطیسی جداسازی و غنی سازی شد. سپس لنفوسیت های T با غلظت های مختلف Hcc در حضور آنتی بادی های مهاری TLR2 در محیط کشت و در زمان های مختلف 24-48 ساعت کشت داده شده و سپس از نظر بیان ژنهای سایتوکاین ها و فاکتورهای نسخه برداری مورد بررسی قرار گرفتند. میزان ترشح سایتوکاین های IL-4 و IL-17 در مایع رویی کشت سلولی، مطابق پروتکل با کیت الیزا بررسی شد. مطالعه ما نشان داد که میزان بیان IL-4 و IL-17 و سطوح ترشحی این سایتوکاین ها بعد از 48 ساعت در حضور قطعه نوترکیب زنجیره سنگین توکسین کزاز تغییر معنی داری نشان نداد. |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
