بررسی اثر سینرژیسم microRNA 193a و microRNA 146a درمهار متاستاز سرطان معده.

مجریان: بهزاد برادران , امیر علی مختارزاده

خلاصه روش اجرا: سرطان شامل گروهی از بیماریهاست که با مشخصههایی مثل رشد کنترل نشده، متاستاز و انتقال سلولهای سرطانی از یک نقطه از بدن به نقطهای دیگر و ایجاد بیماری جدید و همچنین تهاجم طبقه بندی میشود. با وجود پیشرفتهای حاصله همچنان سرطان یکی از مهمترین و بزرگترین و اصلی ترین عامل بیماری و مرگ و میر در جهان میباشد. [1 , 2] نتایج حاصل از مطالعات ژنومیکی و پروتئومیکیسی نشان میدهد که از نقطه نظر ژنتیکی، یک توده سرطانی بسیار پیچیده بوده و حتی میتواند شامل سلولهای سرطانی با ژنوتایپ مختلفی باشد. این شواهد اثبات میکند که علاوه بر عوامل ژنتیکی، محیط و اپیژنتیک نیز میتوانند در نوع سرطان و حتی بروز آن دخالت داشته باشد. با این اوصاف استفاده از روشهای درمانی هدفمند و تخصصی بجای روشهای سنتی مرسوم به دلیل سمیت کمتر و اثرگذاری بیشتر قابل توجه خواهد بود. [3 , 4] سرطان گاستریک (معده) یکی از رایجترین بدخیمیها در جهان است که از نظر شیوع در رتبه چهارم و از نظر مرگ و میر در بین سرطانها رتبه دوم را دارد. بیشتر سرطانهای گاستریک از نوع آنتروم و کارسینوما هستند. آنالیز سنی مبتلایان نشان میدهد که شیوع این سرطان در بین جوانان بیشتر بوده و در حال افزایش است. بیماران با سرطان گاستریک دارای سه ویژگی شدت شیوع، متاستاز و مرگ و میر بالا بوده و میزان تشخیص زودرس، قطع ناحیه توموری وهمچنین نرخ بقای 5 ساله در آنها در حال کاهش است. بیماریزایی سرطان گاستریک همانند دیگر سرطانها به صورت چند مرحلهای و مالتی فاکتوریال میباشد. [5 , 6] در حال حاضر ترکیبی از شیمی درمانی و رادیوتراپی موضعی و همچنین جراحی یک روش درمانی آنتی توموری برای این سرطان میباشد ولی با این حال به خاطر پاره ای از مقاومتها به عوامل شیمی درمانی، در برخی از بیماران درمان بی نتیجه میماند. بدین ترتیب مقاومتهای دارویی، چه به صورت ذاتی و چه اینکه بعداً حاصل شده باشند یکی از اصلی ترین عوامل پیش روی درمان سرطان گاستریک هستند . عقیده بر این است که مقاومت دارویی میتواند علل ژنتیکی و اپیژنتیکی داشته باشد. فرضیه ژنتیکی به جهشهای رخ داده وابسته به دارو در سکانسهای DNA اشاره دارد. از طرف دیگر فرضیه اپیژنتیکی به تنظیمات غیر جهشی وابسته به دارو در عملکرد ژن وابسته است. مکانیسم اصلی مقاومت به شیمی درمانی تاکنون ناشناخته باقی مانده است. از این رو با توجه به ناکامیها در درمان برخی بیماران، از جمله روشهای درمانی تخصصی پیشنهاد شده توسط محققین، ژن درمانی بوسیله microRNA هاست. [6] microRNA ها تک رشته های کوچک غیر کد کنندهای از خانواده RNA ، در تمام سلولهای پستانداران وجود داشته و اغلب دارای 19 - 23 جفت باز هستند. آنها می توانند از طریق باند شدن به قسمت 3 پریم UTR یک mRNA بر روی بیان ژنها تاثیر منفی بگذارند که نتیجه آن عدم بیان آن و حتی تجزیه آن mRNA خواهد بود.[7 , 8]. microRNA ها میتوانند به صورت بالقوه بیش از یک سوم ژنهای کدکننده پروتئینهای درگیر در پروسه های بیولوژیکی مختلف مثل انتقال سیگنال، مسیرهای بیوشیمیایی، تقسیم و تمایز سلولی و همچنین مرگ سلولی را مورد هدف قرار دهند [8]؛ بعلاوه نشان داده شده است که بیان آنها در برخی از سرطانهای انسانی دچار بد تنظیمی شده و این بیان نادرست در تقسیمات تومور، تهاجم و متاستاز تاثیرگذار است. بنابراین آنها میتوانند در تشخیص و غربال گریهای پیش آگاهی بکار رفته و همچنین به عنوان اهداف بدیع برای درمان سرطان استفاده شوند.[8 , 9] اخیرا مطالعات جامع نشان دادهاند که miRNA ها در ایجاد مقاومت به روشهای شیمی درمانی نقش کلیدی دارند. قابلیتهای ویژه آنها در تعیین کردن حساسیت و یا مقاومت دارویی سلولهای سرطانی در مطالعات مختلف نشان داده شده است.[6 , 9] از جمله microRNA های درگیر در سرطان گاستریک میتوان میکرو ار ان ای های 146a و 193a را نام برد. mir146a در تقسیم، تمایز و آپاپتوز سلولی درگیر است. بد تنظیمی و عدم عملکرد این microRNA سبب تومورزایی و ایجاد تیپهای مختلفی از سلولهای سرطانی میشود. این microRNA اثر متفاوتی در سرطانهای مختلف دارد؛ در سرطانهای دهانه رحم و آناپلاستیک تیروئید کارسینوما به صورت آنکوژن و در سرطان سینه و پروستات به صورت تومورساپرسور عمل میکند. همچنین شواهد نشان میدهند که بیان mir146a در سرطان گاستریک کاهش پیدا کردهاست.[10] همچنین mir193a نیز به عنوان یکی از microRNA هایی که در تمام انواع سرطان گاستریک دچار کاهش بیان گردیده، شناسایی شده است ونقش تومور ساپرسوری دارد. یکی از روشهای درمانی در سرطان گاستریک، روشی تحت عنوان (miRNA replacement therapy) هست که در جریان این روش با جایگزینی (miRNA mimic) یا مقلد، با استفاده از وکتورهایی حامل miRNA مورد نظر، میتوان بیان کم و یا از دست رفته miRNA در سلول های هدف را جبران کرد.[11]ابتدا رده سلولی سرطانی گاستریک از پاستور خریداری خواهد شد. سپس این سلولها در محیط کشت RPMI حاوی 10 درصد FBS ، در دمای 37 درجه سانتیگراد و میزان 5 درصد دی اکسیدکربن کشت داده شده تا به تراکم مورد نظر از لحاظ تعدادی برسند.سپس microRNA های خریداری شده از شرکت Microsynth سوئیس با استفاده از کیت و پروتوکول jet prime شرکت polyplus فرانسه وارد سلولهای گاستریک خواهد گردید. بعد از گذشت زمان لازم، بیان برای microRNA 193a-5p و 146a یکبار به صورت جدا از هم و بار دیگر به صورت باهم توسط qRT-PCR بررسی خواهد شد. میزان رشد و پرولیفراسیون سلولهای سرطانی توسط تکنینک MTT مورد بررسی قرار میگیرد. بعد از ترانسفکت هردو microRNA هم به صورت جدا از هم و هم به صورت باهم و گذشت مدت زمان لازم، محیط کشت با محیط کشت حاوی MTT تعویض میگردد و بعد از 4 ساعت انکوباسیوت توسط دستگاه ELISA plate reader جذب نوری در طول موج 570nm قرائت میشود. میزان مهاجرت و متاستاز سلولهای سرطانی بعد از ترانسفکت، بوسیله آزمایش Wound healing assay بررسی میگردد. 510*5 سلول ترانسفکت شده با هردو microRNA های 5p-193a و 146a به صورت باهم و جدا از هم در محیط کشت انکوبه شده و شیاری در محیط ایجاد میشود، بعد از شستشوی محیط با PBS ، انکوباسیون انجام میگیرد و سپس از محل شیار توسط میکروسکوپ عکس برداری میشود و مهاجرت سلولها از لبه شکاف به داخل آن بررسی میگردد. در مرحله اول سه رده سلولی (MKN-45، KATO III، AGS) مورد بررسی قرار خواهند گرفت، میزان بیان هر دو microRNA در درده های سلولی ذکر شده بررسی خواهد شد و رده سلولی که از نظر میزان بیان microRNA های a193 و a146 در کمترین میزان باشد به عنوان رده سلولی مناسب جهت ادامه مطالعه انتخاب خواهد شد، بنابر این در عنوان از آوردن نامه رده سلولی اجتناب شده است.