بررسی اثر ضد میکروبی باکتری Bacillus amyloliquefaciens بر روی تعدادی از پاتوژن های انسانی و گیاهی

مجریان: آزیتا دیلمقانی , سمیه حلاج نژادی

خلاصه روش اجرا: 1- در این پژوهش در ابتدا باکتری Bacillus amyloliquefaciens کشت داده خواهد شد و این باکتری در 30 درجه سانتیگراد به مدت 48، 72 و 96 ساعت در شیکر 150 دور در دقیقه قرار گرفته و برای تعیین مقاومت در مقابل آنتی بیوتیک های مختلف از روش دیسک دیفیوژن استفاده خواهد شد. برای انجام دیسک دیفیوژن سوسپانسیون باکتری با غلظت 5/0 مک فارلند تهیه شده و در محیط کشت TSA کشت داده خواهد شد. دیسک های آنتی بیوتیک بر روی آن قرار داده خواهد شد. برای تعیین مقاومت به آنتی بیوتیک ظرف پتری دیش به مدت 24 ساعت در 30 درجه سانتی گراد انکوبه خواهد شد. پس از آن قطر هاله عدم رشد اندازه گیری شده و سپس نتایج با استفاده از جدول استاندارد دیسک ها بصورت حساس ، حساس نسبی و مقاوم ثبت خواهد شد. برای مثال هاله بزرگ تر از 13 میلی متر حساس ، 11-12 میلی متر مقاوم نسبی و هاله کمتر از 10 میلی متر به عنوان مقاوم به متی سیلین در نظر گرفته خواهد شد. نتایج با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون chi square تجزیه تحلیل می گردد. 2- در این مطالعه خواص ضد باکتریایی و ضد قارچی ، باکتری مورد نظر را با سویه های تجاری مختلف (چهار سویه باکتریا یی بیماریزای انسانی ، چهار سویه باکتریایی بیماریزای گیاهی و چهار سویه قارچی بیماریزای گیاهی) مقایسه خواهد شد. باکتری در محیط مربوطه در دمای 30 درجه سانتیگراد(دمای اپتیمم) به مدت 24 ساعت انکوبه می شود. سپس به منظور جداسازی سلولهای باکتری از محیط کشت از سانتریفیوژ یخچال دار در 4000 دور به مدت 20 دقیقه انجام می گردد. مایع رویی جدا گردیده و برای اطمینان از عدم وجود سلول از فیلتر باکتریایی 45/0 میکرومتر عبور داده خواهد شد. به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی به روش انتشار در محیط آگار استفاده خواهد شد. در داخل محیط کشت چاهک هایی با قطر 5 میلی متر ایجاد کرده و سپس 100 میکرولیتر از باکتری را به داخل چاهک های ایجاد شده در پلیت های حاوی باکتری و قارچهای مورد آزمایش ریخته خواهد شد. سپس پلیت ها در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت نگهداری خواهد شد. پس از اتمام این زمان، انداره هاله های ایجاد شده با استفاده از خط کش اندازه گیری خواهد شد. نتایج با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون chi square تجزیه و تحلیل می گردد. تعیین مقدار بازدارندگی به روش میکرودایلوشن براث: در میکروپلیت های 96 خانه مقدار 100 میکرولیتر محیط TSA همراه سوسپانسون باکتری به تمام چاهکها و مقدار 100 میکرو لیتر از باکتری هایا قارچ ها مورد نظر به چاهکهای اول اضافه می گردد. سپس غلظت های مختلف از میکرو ارگانیسم تهیه شده و در نهایت 100 میکرو لیتر از هر غلظت به چاهکهای مختلف اضافه می گردد. در هر آزمایش از تمام رقتهای سوسپانسیون باکتری بدون میکرو ارگانیسمها بعنوان شاهد منفی جهت مقایسه و از هر میکرو ارگانیسم همراه با محیط کشت بعنوان شاهد مثبت جهت تایید رشد هر میکرو ارگانیسم استفاده خواهد شد. پس از کشت ، میکروپلیت ها شیک شدند تا مخلوط کاملا یکنواخت گردد. سپس میکرو پلیتها به مدت 48 ساعت در داخل انکوباتور در دمای 30 درجه قرار داده و نتایج بعد از 48 ساعت مورد مطالعه قرار خواهد گرفت. آخرین رقتی که مانع رشد میکرو ارگانیسمها گردد بعنوان MIC در نظر گرفته خواهد شد