تولید پلاکت از سلولهای بنیادی خون بند ناف با استفاده از بایوراکتور
Producing platelet from CD34 posetive umbilical cord blood cells by bioreactor
مجریان: حجت اله نوزاد چروده , علی خوش فطرت
خلاصه روش اجرا: پلاکتهااز سلولهای خونی هستند که مهمترین نقش آنها بند آمدن خون موقع خونریزی از قسمتهای آسیب دیده عروق می باشد.تولید پلاکت در مغز استخوان، توسط سلولهای بنیادی مغز استخوان صورت می گیرد. سلولهای بنیادی مغز استخوان در بر همکنش با عوامل مختلف موجود در مغز استخوان تمایز پیدا کرده بعد از تبدیل شدن به سلولهای متعهد سپس به مگا کاریوبلاست، مگاکاریوسیت،سلولهای پیش پلاکتی و در نهایت به پلاکتهای بالغ تبدیل میشوند. تولید پلاکت از سلولهای مگاکاریوسیت بالغ در اثر تکه تکه شدن مگاکاریوسیتها در اثر برخورد باعوامل فیزیکی مختلف از جمله ماتریکس خارج سلولی مغز استخوان ، تعاملات سلول به سلول با سلولهای استرومال و سلولهای اندوتلیال عروقی صورت میگیرد، در نهایت پلاکتهای بالغ از لابه لای سلولهای اندوتلیال وارد گردش خون محیطی می شود.در تولید پلاکتها بغیر از عوامل فیزیکی مغز استخوان عوامل شیمیائی مثل سایتوکاینها وفاکتورهای رشد خونساز موثر هستند. تعداد پلاکتهای خون محیطی به طور متوسط 140-450 هزار برحسب میکرو لیتر خون میباشد و طول عمر آنها 5 تا 7 روزاست ودر نهایت در طحال از بین میروند. با توجه به وجود بیماریهای متعدد خونی و غیر خونی که منجر به کاهش کمی و کیفی در پلاکتها میشوند ، مصرف فراورده های حاوی پلاکت روز به روز گسترش پیدا کرده است . به خاطر کم بودن طول عمر پلاکتی ، مشکلات نگهداری فراورده ،تنوع فراورده های تزریقی و واکنشهای ایمنولوژیک تزریق پلاکت محققین را به فکر تولید پلاکت در آزمایشگاه انداخته است. تولید پلاکت در محیط آزمایشگاه از سلولهای بنیادی مغز استخوان ،خون محیطی ، بند ناف و IPS صورت گرفته است، مزیتهای قابل توجه موجود در سلولهای بنیادی بند ناف شامل تهیه راحت ،تنوع آنتی ژنی کم و دم دست بودن آن می باشد. با توجه به موفقیتهای زیادی که در این زمینه ایجاد شده است ولی محدودیت در تولید حجم و تعداد زیاد پلاکت همچنان وجود دارد. استفاده از بایو راکتور این امکان را میدهد که تعداد پلاکتهای تولید شده به طور قابل توجهی افرایش پیدا بکند. در مطالعه حاضرتولید پلاکت های عملکردی و به طور انبوه از سلولهای بنیادی بند ناف با استفاده از بایو راکتور در حضور ساختارهای مختلف ماتریکس خارج سلولی و انواع مختلف سایتوکاینها صورت خواهد گرفت و پلاکتهای تولید شده از نظر ساختار طبیعی سلول و تواناییهای عملکردی مورد بررسیهای لازم خواهند شد و مفید ترین عوامل موثر برای تولید بهتر پلاکتها از نظر کمی و کیفی معرفی خواهد شد. طی این مطالعه اهداف زیر پیگیری میشوند: 1) تهیه نمونه خون بند ناف با کسب رضایت¬ نامه کتبی 2) جدا سازی سلولهای CD34+ 3) کشت سلولهای CD34+ در محیط کشت سلولی برای تمایز و تبدیل شدن به مگاکاریوسیت والقاء پلی پلوئیدی 4) بررسی میزان تولید مگاکاریوسیتها با فلوسیتومتری 5) کشت مگاکاریوسیتها در محیط کشت سه بعدی( بایوراکتور) برای تمایز و تولید پلاکت 6) انجام فلوسیتومتری برای برسی پلاکتها 7) بررسی ساختار پلاکتهای تولید شده با میکروسکوپ الکترونی 8) بررسی عملکرد پلاکتها با دستگاه اگریگومتر اعلاوه بر اهداف اختصاصی اهداف کاربردی نیز پیکیری خواهد شد و آن راه اندازی (set up) تولید مگاکاریوسیت و پلاکت در محیط آزمایشگاه بخصوص راه اندازی تولید پلاکت با استفاده از بایوراکتور در کشور خودمان می باشد، می توان گفت که تا کنون انجام نشده است. ضمنا سلولهای بنیادی خون بند ناف براحتی قابل دسترس بوده وتنوع آنتی ژنی کمی دارند و به خاطر رایج بودن بانک سلولهای بند ناف امکان استفاده از نمونه خودی (اتولوگ) هم وجود دارد. همچنین استفاده از سلولهای بنیادی بند ناف برای تولید پلاکت طی دو مرحله کشت معمولی جهت تمایز به مگاکاریوسیت و بایوراکتور جهت تبدیل مگا کاریوسیت به پلاکت توامان مورد بررسی قرار نگرفته ، که در این مطالعه بررسی خواهد شد.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 60432 |
| عنوان فارسی طرح | تولید پلاکت از سلولهای بنیادی خون بند ناف با استفاده از بایوراکتور |
| عنوان لاتین طرح | Producing platelet from CD34 posetive umbilical cord blood cells by bioreactor |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | سلولهای بنیادی، مهندسی بافت و پزشکی بازساختی و زیست مواد |
| نوع مطالعه | راه اندازی روش یا سیستم علمی / اجرایی |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | دکتری تخصصی PhD |
| مدت اجرا - ماه | 24 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | تولید پلاکت ( ترومبوپوئز )یک پروسه پیچیده است که پلاکت از سلولهای بنیادی خون ساز مغز استخوان تولید میشود . سلولهای بنیادی مغز استخوان سلولهای چند قوه هستند که رده های مختلف سلولهای خونی را تولید می کنند ، سلولهای بنیادی مغز استخوان خاصیت خود نوسازی و تمایز را دارند و به سلولهای پیش ساز لنفوسیت (CLP) ، سلولهای پیش ساز میلوئیدی(CMP) تبدیل می شوند. CMP ها به دو پیش ساز میلوئیدی/ماکروفاژی و مگاکاریوسیت/اریتروسیت(MEP) تمایز پیدا می کنند این سلولها در بر همکنش با عوامل مختلف موجود در مغز استخوان طی فرایند پیچیده تمایز پیدا کرده بعد از تبدیل شدن به مگاکاریوبلاست، مگاکاریوسیت،سلولهای پیش پلاکتی در نهایت به پلاکتهای بالغ تبدیل میشوند. مگاکاریو بلاستها توانایی اندومیتوز دارند و با این مکانیسم محتوای ژنتیکی خود را افزایش میدهند [1]، مگاکاریوسیتها فعالیت گسترش سیتوپلاسم خود را دارند و با این مکانیسم اندازه خود را افزایش داده و قطر خود را به بیش از 50 میکرون میرسانند که بزرگترین سلول خونی در مغز استخوان است و تحت هیچ شرایطی وارد خون محیطی نمیشوند[2]، مگاکاریوسیتهای بالغ دارای demarcation membrane system (Dm) هستند و از این طریق تکه تکه شده و پلاکتهای جوان را بوجود می آورند[3][4]. فرایند تولید پلاکت در مغز استخوان در دو نیچ استخوانی و عروقی صورت میگیرد، در نیچ استخوانی تمایز سلولهای بنیادی و در نیچ عروقی تولید پلاکتها از سلولهای مگاکاریوسیت بالغ در اثر تکه تکه شدن مگاکاریوسیتها در اثر برخورد باعوامل فیزیکی مختلف از جمله ماتریکس خارج سلولی مغز استخوان ، تعاملات سلول به سلول با سلولهای استرومال و سلولهای اندوتلیال عروقی صورت میگیرد[5]، در نهایت پلاکتهای بالغ از لابه لای سلولهای اندوتلیال وارد گردش خون محیطی می شود. در تولید پلاکتها بغیر از عوامل فیزیکی مغز استخوان عوامل شیمیائی مثل سایتوکاینها وفاکتورهای رشد خونساز موثر هستند، که شامل ترمبوپویتین، IL6،IL3،IL11، GM-CSF، SCF، FLT3-L می باشند[5]. پلاکت دومین سلول خون محیطی بعد از گلبولهای قرمز از نظر تعداد می باشد و اولین سلول موثر در ایجاد انسجام عروقی در مقابل خونریزی است پلاکت وظایف دیگری مانند شرکت در فعالیتهای سیستم ایمنی (عرضه آنتی ژن ، شرکت درالتهاب ، تولید سایتوکاین و حتی فاگوسیتوز)، شرکت در آنژیوژنزیس،متاستاز تومور و بیماریهای قلبی و عروقی را دارد[6] . تعداد پلاکتها در افراد بالغ نرمال 140-450 هزار بر حسب میکرولیتر خون محیطی می باشد. شیوع بالای بیماریهای مختلف ارثی و اکتسابی مربوط به کمیت و کیفیت عملکرد پلاکت موجب اختلالات خونریزی دهنده و بیماریهای افزایش انعقاد پذیری میگردد که هر دو مورد از علل قابل توجه مرگ و میر در دنیا می باشند[2]، کاهش پلاکت یا ترمبوسیتوپنی در مواردی مانند بیماریهای خونی ، بیماریهای غیر خونی ، سرطانها ،بیماریهای ایمنولوژیک و غیره دیده میشود. کاهش شدید پلاکت در اغلب موارد با تزریق فراورده پلاکتی همراه است[2][7]، به دلیل محدودیتهای آزمونهای سازگاری پلاکتی و پلی مورف بودن آنتی ژنهای پلاکتی اغلب مقاومت پلاکتی بعد از تزریق در اثر تولید آنتی بادی ناسازگار اتفاق می افتد ، این تنوع آنتی ژنی در فراورده های random donor بسیار بیشتر است. دمای نگهداری فراورده پلاکتی دمای اتاق (22°) میباشد و میانگین طول مدت نگهداری فراورده پلاکتی در بانک خون 72 ساعت میباشد. که از محدودیتهای این فراورده نسبت به سایر فراورده های انتقال خون محسوب میشود و عامل اصلی کمبود این فراورده در مراکز درمانی میباشد[3]. تولید پلاکت در آزمایشگاه با استفاده از انواع مختلف سلولهای بنیادی(HSC ، استم سلهای خون محیطی ، بند ناف وIPSC) امکان پذیر می باشد،سلولهای CD34+و CD133+ از زیر رده های سلولهای بنیادی بند ناف هستند که به پلاکت تمایز میابند. از جمله مزایای سلولهای بنیادی خون بند ناف تهیه راحت ،تنوع آنتی ژنی کم و دم دست بودن آن می باشد. محیطهای کشت سلولی معمولی اغلب توانایی تولید پلاکت کافی را ندارند چون برای تولید پلاکت نیاز به برهمکنشهای فیزیکی با سطوح و سلولهای مختلف و نیروی حاصل از جریان لازم است به همین خاطر استفاده از محیطهای کشت سه بعدی و بهتر از آن استفاده از بایوراکتوربسیار قابل توجه می باشد. [4] در مطالعه حاضرتولید پلاکت های عملکردی و به طور انبوه از سلولهای بنیادی بند ناف با استفاده از بایو راکتور در حضور ساختارهای مختلف ماتریکس خارج سلولی و انواع مختلف سایتوکاینها صورت خواهد گرفت. . بر خلاف مطالعات قبلی که ملاک تخلیص سلولهای بنیادی فقط وجود CD34 بود در این مطالعه سلولهای بنیادی بند ناف استفاده شده - CD133 و +CD34 خواهند بود که نسبت به سلولهای +CD133 و +CD34 توانایی تمایز بیشتری به رده مگاکاریو سیتی را دارا می باشند ،[14] ازپلی مرهای منفذدار وهیدروژل هیالورونان همراه با فیبرین انسانی وکلاژن نوع I و سلولهای اندوتلیال در بایوراکتور برای تبدیل مگاکاریوسیتها به پلاکت استفاده خواهد شد ،گیرنده فیبرینوژن CD41,GPIIb/IIIa) /CD61) و گیرنده کلاژن( GPIa/IIa; CD49b/CD29) بر سطح مگا کاریوسیت و پلاکت وجود دارد [1]و میتوان از این ترکیب(هیالورونان همراه فیبرین و کلاژن نوع I و سلولهای اندوتلیال ) که تا به حال در بایوراکتور برای ترومبوپویز استفاده نشده است، بهره جست. با ترکیب سایتوکاینهای مختلف مثل TPO ، SCF، IL3 و IL6 هم در کشت سلولی برای مگاکاریوپوئزیس و القای پلی پلوئیدی هم در بایو راکتور برای ترومبوپوئزیس استفاده خواهد شد. جهت افزایش پلی پلوئیدی از مهار کننده پلیمریزه کننده اکتین latrunculin بهره خواهیم برد که باعث افزایش مگاکاریوسیتهای 8N کروموزومی میشود[2].قبلا از تیوپهای با ساختار سیلک و شیشه استفاده شده که به خاطر بار منفی آنها باعث تحریک پلاکتها و منجر به غیر فعال شدن آنها میشود ،استفاده از تیوپهای پلی مری این اثر فعال کنندگی بر روی پلاکت را نداشته می تواند در تولید پلاکتها عملکردی موثر باشد. پلاکتهای تولید شده از نظر ساختار طبیعی سلول با استفاده از میکروسکوپ الکترونی و تواناییهای عملکرد پلاکت با دستگاه اگرگومتر بررسی خواهد شد، و مفید ترین عوامل موثر برای تولید بهتر پلاکتها از نظر کمی و کیفی معرفی خواهد شد |
| اهداف اختصاصی | بررسی تولید مگاکاریوسیت از سلولهای بنیادی خون بند ناف -بررسی تولید پلاکت از مگاکاریوسیت با استفاده از بایوراکتور -بررسی تاثیر انواع سایتوکاینها بر میزان تولید مگا کاریوسیت و پلاکت -بررسی تاثیر نوع ماتریکس خارج سلولی بر میزان تولید مگا کاریوسیت و پلاکت |
| چکیده انگلیسی طرح | Producing platelet from CD34 posetive umbilical cord blood cells by bioreactor Producing platelet from CD34 posetive umbilical cord blood cells by bioreactor |
| کلمات کلیدی | 1. مگاکاریوپوئز:تمایز سلولهای پیش ساز خونساز به سلولهای مگاکاریوسیت را گفته میشود که در مغز استخوان تحت تاثیر TPO ، IL3 و سایر عوامل تمایز صورت میگیرد 2. ترومبوپوئز: تولید پلاکت از سلولهای پیش ساز پلاکت را گفته میشود که به طور طبیعی در مغز استخوان تحت تاثیر فاکتورهای رشد خونساز مثل ترومبوپویتین و عوامل دیگر مثل بر همکنش با سایر سلولهای غیر خونی مغز استخوان و ماتریکس خارج سلولی صورت میگیرد. 3. ترومبوسیتوپنی :: (Thrombocytopenia) به اختلال کمی در پلاکتهای خون یا ترومبوسیتها گفته میشود. این اختلال بیشتر به کاهش تعداد آنها به کمتر از ۱۴۰۰۰۰ در هر میکرولیتر خون٬ بازمیگردد 4. demarcation membrane system (Dm) : سیستم تیوبولار در زیر غشای سیتوپلاسمایی مگاکاریوسیتها میباشد که در جدا شدن تکه های پلاکتی نقش دارد 5. bioreactor: اشاره به هر گونه دستگاه مهندسی شده یا ساخته شده که یک محیط فعال از نظر زیستی را حمایت می کند که از آن به منظور سلول ها یا بافت ها در زمینه کشت سلولی استفاده می شود. این دستگاه ها برای استفاده در مهندسی بافت و کشت سلولها استفاده میکنند |
| ذینفعان نتایج طرح | ترومبوسیتوپنی از جمله مهمترین و پر خطرترین یافته بیماران خونی، سرطانی ،شیمی درمانی ،خیلی از موارد بیماریهای عفونی ، داخلی و ایمنولوژیک میباشد[7][8]. تزریق پلاکت درمان اصلی اکثر بیماران مبتلا به ترومبوسیتوپنی است ،با توجه به محدودیتهای نگهداری پلاکت از جمله طول عمر کم(5-7 روز) ، غیر قابل نگهداری بودن در دمای 4 درجه ، به خاطر از کار افتادن فعالیت سلول ،آلودگی با عوامل عفونی به خاطر نگهداری در دمای اتاق و تغییرات ph ( به خاطر تخمیر قندها توسط سلولهای غیر پلاکتی موجود در کیسه) ، کمبود فراورده پلاکتی از چالشهای عمده سرویسهای انتقال خون جهان می باشد[9][2]، در ایالات متحده سالانه 31% فراورده های پلاکتی به خاطر همین محدودیت از بین میرود[5]. نیاز روز افزون به فراورده پلاکتی کافی ، سالم از نظر عوامل عفونی و سازگاراز نظر HLA و آنتی ژنهای اختصاصی پلاکت محققین را به فکر تولید پلاکت از سلولهای بنیادی در آزمایشگاه نموده است[2][4] |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| حجت اله نوزاد چروده | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| علی خوش فطرت | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| زهره صناعت | مشاور |
| علی اکبر موثق پور اکبری | مشاور |
| محمد حسین درختی گنبد | دانشجوی مالک پایان نامه |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر تولید پلاکت با استفاده از اسکافولد کلاژن-کتیرا در بیورکتورهای چند کاناله ار سلول های بنیادی خون بند ناف می تواند قابل تولید باشد.متن خبر پلاکت ها نقش اساسی در درمان ترومبوسیتوپنیا دارند و تزریق پلاکت الوژنیک در این بیماری یکی از روش های درمانی اصلی می باشد. با توجه به اینکه اماده سازی و ذخیره پلاکت ها دارای محدودیت هایی می باشد ، پژوهشگران دنبال روش های جایگزین تولید پلاکت با استفاده از بیورکتورها از سلولهای بنیادی مختلف می باشند.در این مطالعه از سلول های بنیادی خون بند ناف و از بیورکتور 6 کاناله با اسکافولاد دو لایه کلاژن – کتیرا و یکسری فاکتورهای ماتریکس خارج سلولی جهت ایجاد محیط مشابه مغز استخوان استفاده شد. برای تبدیل مگاکاریوسیت ها به پلاکت ها هم از فشار مایع و تماس بین ساختمان اسکافولد و فاکتورهای خارج سلولی استفاده شد. سلول های CD41 مثبت 100 برابر از سلول های CD34 مثبت خون بند ناف تولید شدند وقتی از اسکافولد خالی کلاژن استفاده شد، میزان تولید پلاکت 18 درصد بود ولی وقتی فیبرین ، فیبرونکتین، هیالورنیک اسید و کرایوپرسیپیتیت اضاف شد تولید پلاکت ها به ترتیب 21 ، 22، 24 و 27 درصد بود. وقتی از کتیرا با کلاژن استفاده شد میزان تولید پلاکت ها 23درصد بود. که با افزودن فاکتورهای کلاژنی و بین سلولی به 34 درصد رسید. بنابرین اسکافولد کلاژن و کتیرا با بیورکتورهای چند کانله می تواند برای تولید پلاکت مناسب باشد. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
