مقایسه ی روشهای مختلف استخراج قطعات آنتی بادی نوترکیب scFv و VL ازفضای پری پلاسمی باکتری اشرشیا کلی
Comparison of various methods for extraction of recombinant scFv and VL antibody fragments from periplasm space of E. coli
مجریان: بهزاد برادران , محمد رضا توحیدکیا
خلاصه روش اجرا: برای این مطالعه از دو کلون بیان کننده آنتی بادی های محلول scFv و VL اختصاصی هورمون پپتیدی گاسترین که در سویه HB2151 کلون شده است استفاده خواهد گردید. برای بیان این آنتی بادی های مورد نظر ابتدا 10سی سی محیط کشتxYT2 حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین و 1 درصدگلوکز با یک کلنی منفرد Ecoli از محیط کشت پلیت TYE شبانه انکوبه می شود. روز بعد از کشت شبانه مجددا در کشت xYT2 حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین و 1 درصدگلوکز بمدت دو ساعت در حالت چرخش و 37 درجه تا رسیدن به جذب نوری 9/0 انکوبه می شود. پس از سانتریفوژ، پلت باکتری در محیط کشت 2xYT حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین و1 میلی مولار IPTG در دمای 37 بمدت 5 ساعت در حال چرخش درجه انکوبه میگردد. استخراج: بعد از5 ساعت القا بیان آنتی بادی ها کشت باکتری سانتریفوژ و پلت سلولی جمع آوری می گردد. متعاقبا توسط 5 روش مختلف اقدام به استخراج scFv از ناحیه پری پلاسم می شود. و در نهایت پس از سانتریفوژ مجدد میزان آنتی بادی های رها شده به مایع رویی توسط روش های SDS-PAGE و الایزا تعیین می شود.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 60369 |
| عنوان فارسی طرح | مقایسه ی روشهای مختلف استخراج قطعات آنتی بادی نوترکیب scFv و VL ازفضای پری پلاسمی باکتری اشرشیا کلی |
| عنوان لاتین طرح | Comparison of various methods for extraction of recombinant scFv and VL antibody fragments from periplasm space of E. coli |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | --- غیر اولویت دار (جزو اولویت های دانشگاه نمی باشد) |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | خیر |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | کارشناسی ارشد |
| مدت اجرا - ماه | 10 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | روش های مختلف استخراج پروتئین ها از ناحیه پری پلاسمی باکتری وجود دارد که برخی همراه با استخراج ناکامل بوده و برخی هم باعث آسیب به غشا داخلی باکتری و آزاد شدن پروتئین ها سیتوپلاسمی و لذا آلودگی استخراج پری پلاسمی با پروتئین های سیتوپلاسمی خواهد گردید. لذا مطالعه حاضر روش های مختلف استخراج آنتی بادی (از جمله کلروفورم، پلی میکسن، شوک اسمزی، لیزوزیم و تریس-EDTA-ساکارز) های scFv از ناحیه پری پلاسمی باکتری ایشریشیا بررسی و مقایسه خواهد کرد تا بهترین روش با بیشترین مقدار استخراج آنتی بادی های عملکردی و کمترین آلودگی با پروتئین های پری پلاسمی را تبین کند. تا بحال مطالعه سیستماتیک در ارتباط با روش های مختلف استخراج پری پلاسمی در مورد قطعات آنتی بادی scFv صورت نگرفته است و این مطالعه برای اولین بار هست که اجرا خواهد شد. |
| اهداف اختصاصی |
بررسی تاثیر روش لیزوزیم بر روی میزان استخراج قطعات آنتی بادی نوترکیب scFv ازفضای پری پلاسمی باکتری اشریشیاکلی -
بررسی تاثیر روش پلی میکسین بر روی میزان استخراج قطعات آنتی بادی نوترکیب scFv ازفضای پری پلاسمی باکتری اشریشیا کلی -بررسی تاثیر روش کلروفرم بر روی میزان استخراج قطعات آنتی بادی نوترکیب scFv ازفضای پری پلاسمی باکتری اشریشیا کلی |
| چکیده انگلیسی طرح | For this study, two clones expressing scFv and VL soluble antibodies specific for gastrin peptide hormone, cloned in HB2151 strain, will be used. To express these antibodies, 10 cc of xYT2 culture medium containing ampicillin and 1% glucose is first incubated with a single Ecoli colony from TYE plate culture medium overnight. The day after night culture, it is incubated again in xYT2 culture containing ampicillin antibiotic and 1% glucose for two hours in rotation and 37 degrees until light absorption of 0.9. After centrifugation, the bacterial pellet is incubated in 2xYT medium containing ampicillin and 1 mM IPTG at 37 ° C for 5 hours. |
| کلمات کلیدی | قطعات تک زنجیره ای ناحیه متغیر آنتی بادی زنجیره سبک ناحیه متغیر آنتی بادی فاژ دیسپلی روش های استخراج |
| ذینفعان نتایج طرح | مراکز تحقیقات دارویی،مراکز تحقیقات ایمونولوژی ،مراکزدرمان سرطان |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| بهزاد برادران | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| امیر علی مختارزاده | مشاور |
| سلطانعلی محبوب | مشاور |
| محمد رضا توحیدکیا | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| الهام قمقامی | دانشجوی مالک پایان نامه |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر متن خبر |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر روش استخراج قطعات آنتی بادی scFv از ناحیه پری پلاسمی با کتری ایشریشیا کولی برای متغیرهای مختلف موجود در بافر پری پلاسمی بهینه گردید.متن خبر قطعات متغیر تک زنجیره ای (scFvs) به دلیل تولید ساده در E. coli ، توجه بیشتری را در بین محققان در زمینه های دانشگاهی و صنعتی به دست آورده اند. پری پلاسما باکتری E. coli به دلیل وجود مخلوط اکسید کننده آن ، تسهیل شکل گیری صحیح پیوند دی سولفید ، محل مورد نظر برای بیان مولکولهای scFv بوده است. از این رو ، بازیابی ملکولهای فعال بیولوژیکی از فضای پیرپلاسمی یک گام مهم در فرایندهای پایین دست می باشد. TES (Tris / EDTA / ساکروز) به عنوان یک روش استخراج ساده و کارآمد اما تحت شرایط متغیر مورد استفاده قرار گرفته است. این مطالعه ، برای اولین بار با هدف بررسی اثرات چهار متغیر مستقل (یعنی غلظت تریس-هیدروکلراید ، pH بافر ، غلظت EDTA و زمان ) و اثر متقابل آنها بر عملکرد استخراج عملکردی آنتی بادی scFv از فضای پیرپلاسمی E. coli صورت میگیرد. نتایج نشان داد که غلظت Tris-HCl و pH مهمترین متغیرها در روش TES هستند و در مقادیر پایین تر آنها بر عملکرد استخراج عملکردی اثر مثبت نشان داده اند. در این مطالعه شرایط بهینه استخراج قطعات scFv از ناحیه پری پلاسمی HB2151 با استفاده از روش استخراج TES به شرح زیر شناسایی گردید: 50 میلی مولار تریس-هیدروکلراید با pH 7.2 ، 0.53 مولار EDTA و زمان انکوباسیون 60 دقیقه. |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر متن خبر |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
