اثر سلولهای بنیادی مزانشیمال یا ترشحات آنها بر بیان ژنهای VCAM-1،IFN-gamma ،IL- 12 و ICAM-1 در بافت ریه رتهای نر حساس شده با اووالبومین

مجریان: مهدی احمدی

خلاصه روش اجرا: 90 سر رت نر نژاد ویستار به وزن تقریبی 200-250 گرم (8-6 هفته) پس از خرید به مرکز نگهداری حیوانات دانشگاه علوم پزشکی تبریز انتقال داده می شود. غذا و آب آزادانه در اختیار آنها قرار می گیرد و تاریکی و روشنایی 12 ساعته رعایت می شود و دما و رطوبت محیط حیوانخانه ثابت نگه داشته میشود. 10 روز پس از انتقال (به منظور رفع استرس و تطابق با محیط جدید)، ده عدد رت به طور تصادفی ساده به منظور استخراج سلولهای بنیادی مزانشیمال انتخاب شده و بقیه رتها به طور تصادفی ساده به 8 گروه زیر تقسیم می شوند: 1. گروه کنترل که محلول PBS داخل وریدی دریافت میکند. 2. گروه کنترل که محلول PBS داخل تراشه دریافت میکند. 3. گروه آسم که محلول PBS داخل وریدی دریافت میکند. 4. گروه آسم که محلول PBS داخل تراشه دریافت میکند. 5. گروه آسم که سلولهای بنیادی مزانشیمال وریدی دریافت میکند 6. گروه آسم که سلولهای بنیادی مزانشیمال داخل تراشه دریافت میکند. 7. گروه آسم که ترشحات سلولهای بنیادی مزانشیمال وریدی دریافت میکند. 8. گروه آسم که ترشحات سلولهای بنیادی مزانشیمال داخل تراشه دریافت میکند. القای آسم تجربی: به منظور القای آسم تجربی دررتها،1 میلی گرم اوالبومین به همراه 200میلی گرم هیدروکسید آلومینیوم بصورت داخل صفاقی در روزهای اول و هشتم تزریق می شود. سپس حیوان از روز چهاردهم به مدت 18 روز از طریق بینی در معرض آئروسل اوالبومین 4% قرار می گیرد. به طور کلی مدت زمان القا آسم تجربی 32 روز خواهد بود(1) . استنشاق در داخل استوانه ای با ارتفاع 22 سانتی متر و قطر 19 سانتی متر و حجم 6234 سانتیمتر مکعب صورت می گیرد (2, 3). جداسازی و کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: حیوان بیهوش شده و به روش cervical dislocation کشته خواهد شد. سپس استخوان های ران جدا شده (4)، و دو انتهای استخوان از محل اپی فیز به کمک قیچی قطع میشود. با استفاده از سرنگ پر شده با DMEM و با تکنیک flushing مغز استخوان را کاملا داخل فالکون خالی کرده وسوسپانسیون بدست آمده را از صافی رد کرده و سپس سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را برمیداریم. سوسپانسیون بدست آمده را داخل محیط کشتDMEM/LG میریزیم(5) و آن را داخل انکوباتور به مدت یک تا دو هفته میگذاریم و هر دو سه روز یکبار محیط کشت را عوض میکنیم تا سلولهای غیر مزانشیمی کنده شده و از محیط خارج شوند (6). تکثیر سلولها و پاساژ: پس از پوشیده شدن کف فلاسک به وسیله سلولهای مغز استخوان و دستیابی به تراکم سلولی حدود 80%- 70% ، محیط کشت را آسپیره کرده و trypsin-EDTA را به ظرف اضافه کرده وآن را داخل انکوباتور خواهیم گذاشت تا جدا سازی سلولی انجام شود. بعد از دست یابی به جدا سازی سلولی به منظور خنثی سازی اثر تریپسین ، حجم برابر با تریپسین اضافه شده، محیط کشت DMEM حاوی ده درصدFBS اضافه میکنیم و سوسپانسیون بدست آمده را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را برمیداریم. سپس به فلاسک جدید با تعداد 50000 سلول به ازای هر سانتی مترمربع سلول plate می¬شود. هر سه روز یک بار محیط کشت را عوض میکنیم و بعد از سه پاساژ متوالی سلولها تعیین هویت میشوند (6). ایمنوفنوتیپ سلول های بنیادی: برای تعیین هویت سلولهای بنیادی مزانشیمال از شاخص های آنتی ژنیک استفاده میشود(7).برای تعیین هویت سلولهای بنیادی مزانشیمال از شاخص های آنتی ژنیک CD45, CD34, CD105, CD90 استفاده خواهد شد. بااستفاده از دستگاه فلوسایتومتری FACS caliburدرصد سلولهای مثبت مشخص و نتایج حاصله از این دستگاه به صورت هیستوگرام و نرم افزار Cell Quest بیان میشود (4). نشاندار کردن سلولهای بنیادی مزانشیمال به منظور بررسی نحوه انتشار آنها در بافت ریه: به منظور tracking سلولهای تزریق شده در بافت ریه و بررسی نحوه انتشار در ریه حیوان گیرنده، MSCsجدا شده توسط یک ماده فلوروسانت بنام cell trackerرنگ آمیزی میشوند برای این منظور سلول ها به مدت 20 دقیقه با غلظت 20 میکرومول از این ماده در دمای 37 درجه سانتی گراد مجاور می شوند. سپس پس از سه بار شستشو تعداد 2 میلیون سلول به دو حیوان از حیوانات هر یک از گروههای 5 و 6 به ترتیب به صورت وریدی و داخل تراشه تزریق می گردد. (5). جمع آوری ترشحات سلولهای بنیادی: ترشحات سلولی یا پاراکرینی در محیط کشت القایی یا Conditioned media جمع آوری می شوند. برای این منظور بعد از تراکم 80-70% سلول های بنیادی مزانشیمی ،محیط کشت خالی شده و سپس 3 بار با محلول PBS شستشو داده می شوند. در نهایت محیط کشت خالی بدون FBS ریخته می شود. و به مدت 48-24 ساعت انکوبه شده و بعد از این زمان محیط کشت رویی به داخل تراشه تزریق می شود(5). تزریق سلولهای بنیادی مزانشیمال یا ترشحات آنها به حیوانات آسمی: روز سی وسوم (یک روز پس از اتمام پروتوکل القای آسم)، به گروههای آسمی 50 میکرولیتر محلول PBS به صورت وریدی (گروه3) و داخل تراشه (گروه4)، دو میلیون سلول بنیادی مزانشیمال به صورت وریدی (گروه5) و داخل تراشه (گروه6)و 50 میکرولیتر ترشحات محیط کشت به صورت وریدی (گروه7 )یا داخل تراشه (گروه8) تزریق خواهد شد (8, 9). لازم به ذکر است که با توجه به مطالعات قبلی مشخص شده است که اثرات القا آسم با این روش تا 17 روز تغییر نمیکند(10, 11).در گروهای کنترل، 50 میکرولیتر محلول PBS به صورت وریدی (گروه1) و داخل تراشه (گروه2) تزریق خواهد شد. ذکر این نکته ضروری است که در مطالعات قبلی ما نشان دادیم که تزریق داخل وریدی و داخل تراشه سلول بنیادی مزانشیمال یا ترشحات آن به حیوان سالم بی تاثیر است (12, 13).پس از اتمام تمام پروتوکلهای ذکر شده (46 روز ) نهایتا حیوانات با تزریق داخل صفاقی کتامین ( mg/kg 50) و زایلازین (5 mg/kg) بیهوش شده (14) و مطالعات زیر صورت خواهد گرفت: 1) ردیابی سلولها در بافت ریه بعد از تزریق: بخشی از نمونه های بافت ریه در گروههای 5 و6 درمحلول OCT در دمای 80- فریزر میگردند. سپس برش های بافتی 6- 5 میکرومتری تهیه شده و نحوه انتشار سلول ها در بافت ریه توسط میکروسکوپ فلورسانت بررسی می شود (5). 2) تعیین بیان ژنهای VCAM-1،IFN-gamma ،IL- 12 و ICAM-1 در بافت ریه : 1- 2) استخراج RNA توتال ازبافت ریه: دو هفته بعد از تزریق ، ریه چپ هر حیوان خارج و بعد از قرار دادن در نیتروژن مایع ، بلافاصله در یخچال 80- فریز خواهد شد.سپس RNA توتال از بافت ریه هموژن با استفاده از کیت مخصوص استخراج خواهد شد. غلظت و خلوص RNA استخراج شده با استفاده از NanoDrop 1000 Spectrophotometer (آمریکا )بررسی و مورد تایید قرار خواهد گرفت. 2-2) سنتزcDNA ازRNA استخراج شده برای سنتزcDNA ازRNA استخراج شده ازکیت مخصوص حاوی آنزیمReverse Ttranscriptase استفاده خواهد شد. 2-3) انجام qPCR برای سنجش کمی میزان بیان ژنهای مورد نظر تکنیک Real-Time PCR با استفاده از SYBR Green qPCR Master Mix انجام خواهد گرفت. SYBR Green توانایی اتصال به شیار بزرگ DNA دو رشته ای را داشته و در این حالت این مولکول طول موج 494 نانومتر را جذب کرده و نور فلورسنتی با طول موج 521 نانومتر (نور سبز رنگ) از خود ساطع میکند که توسط دستگاه دکتور مورد شناسایی و جمع آوری قرار میگیرد. میزان سیگنال فلورسنت شناسایی شده در هر سیکل نشان دهنده مقدار DNA دو رشته ای و در واقع مقدار محصول PCR انجام شده در آن سیکل است که در قالب ct جمع آوری میگردد.در روش Real-Time PCR برای تعیین میزان بیان یک ژن از مقایسه محصول PCR آن با یک ژن مرجع به عنوان کنترل استفاده میشود.. در این مطالعه از ژن GAPDH به عنوان ژن مرجع استفاده خواهد شد. پرایمرهای مورد استفاده برای انجام واکنش Real-Time PCR با استفاده از نرم افزار Oligo7 طراحی و از نظر اختصاصی بودن محصول مورد بلاست قرار خواهد گرفت. پس از تکثیر، به منظور تایید محصول اختصاصی، عدم وجود پرایمر دایمر و عدم حضور محصول غیراختصاصی منحنی ذوب بدست آمده توسط دستگاه مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت. به منظور آنالیز داده های ct بدست آمده و برای مقایسه بیان ژنهای هدف ، روش 2-∆∆CT مورد استفاده قرار گرفته و میزان بیان ژنهای مورد نظر نسبت به ژن مرجع (Fold change) محاسبه و مورد آنایز آماری قرارخواهد گرفت(15).در روش2-∆∆CT با فرض اینکه Efficiency ژن موردنظر و ژن مرجع باهم برابر هستند می توانیم تغییراتی را در فرمول ایجاد کنیم. دراین حالت نسبت ژن موردنظر و ژن مرجع را قبل و بعد از Treatment بدست آورده و برهم تقسیم میکنیم. 3 ) محاسبات آماری نتایج بصورت میانگین±خطای استاندارد از میانگین(Mean ± SEM) بیان خواهند شدند. نتایج گرو های وریدی باهم و گروههای داخل تراشه نیز با هم مقایسه خواهند شدند . برای انجام محاسبات آماری از نرم افزار SPSS و برای رسم نمودارها از نرم افزار Sigma plot استفاده خواهد شد. . نتایج با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه(ANOVA) و تست تکمیلی Tukey مقایسه خواهند شد. معیار معنی دار بودن نتایج در این طرح p<0.05است.