بررسی اثر ترکیبی Dimethyl fumarate و Ruxolitinib در درمان آنسفالیت خود ایمن تجربی (EAE) به عنوان مدل حیوانی بیماری مالتیپل اسکروزیس (MS)

مجریان: بهزاد برادران , زهره بابالو

خلاصه روش اجرا: این مطالعه از نوع مداخله ای- تجربی است. جامعه مورد مطالعه، شامل 50 سر موش ماده خالص (inbred) نژاد C57BL/6 در محدوده سنی 6 تا 8 هفته خواهند بود که از انستیتو پاستور ایران خریداری خواهند شد. این حیوانات پس از خریداری در شرایط استاندارد آب، غذا، دما و نور کافی نگه داری خواهند شد. - جهت القا بیماری، پپتید MOG بااجوانت کامل فروند و سم سیاه سرفه (PTX) به هر موش C57BL/6 تزریق خواهد شد. روند بیماری روزانه توسط یک فرد و در ساعات مشخصی از روز مورد بررسی قرار خواهد گرفت و شدت بیماری از صفر: عدم مشاهده علائم بالینی در موش ها 0.5: مشاهده فلج جزئی در دم موش ها 1.0: مشاهده فلج کامل در دم موش ها 1.5: مشاهده فلج کامل به همراه ضعف در یکی از اندام های عقبی به صورت جزئی 2.0: مشاهده فلج کامل دم به همراه ضعف در یکی از اندام های عقبی به صورت قوی 2.5: : فلج کامل اندام های عقبی به صورت یک طرفه 3.0: فلج کامل اندام های عقبی به صورت دو طرفه 3.5: فلج کامل اندام های عقبی به صورت دو طرفه همراه با ضعف در اندام های قدامی 4.0: فلج کامل چهار اندام (تتراپالژی) 5.0: رو به مرگ درجه بندی خواهد شد. جهت بررسی تأثیر DMF و Ruxolitinib 50 سر موش در 5 گروه (در هر گروه 10 عدد موش) با شرا یط سنی و وزنی یکسان به طور تصادفی تقسیم خواهند شد و تا 30 روز پس از القا EAE تحت درمان با DMF و Ruxolitinib قرار خواهند گرفت. کروه اول به عنوان گروه نرمال در نظر گرفته خواهد شد که نه القا بیماری خواهیم داشت و نه دارو دریافت خواهند کرد.گروه دوم، گروه کنترل بوده که دارونما دریافت خواهند کرد. گروه سوم دریافت کننده DMF خوراکی با دوز 100mg/kg بصورت روزانه، گروه چهارم دریافت Ruxolitinib خوراکی با دوز 75mg/kg روزانه و گروه پنجم DMF و Ruxolitinib رابصورت روزانه و با هم دریافت خواهند کرد. قابل ذکر است که دوز دارو طبق مطالعات قبلی صورت گرفته انتخاب شده است. پس از گذشت 30 روز از القا EAE و تحت درمان قرار گرفتن با داروهای ذکر شده، از پنج گروه ذکر شده، پنج موش کشته شده و پنج عدد دیگر از هر گروه جهت بررسی تاثیر درمان ترکیبی Dimethyl fumarate و Ruxolitinib در میزان بقا نگه داری خواهند شد. از موش ها کشته شده و نمونه های طحال، طناب نخاعی، ساقه مغز جهت انجام آزمایشات جدا می گردند. در مرحله بعد، نخاع حیوانات خارج و در محلول پارافرمالدهید 4% قرار خواهد گرفت. نمونه ها 48 ساعت پس از تثبیت در محلول فرمالین، جهت پاساژ بافتی در داخل دستگاه آماده ساز ی قرار خواهند گرفت. پس از پاساژ بلوکهای پارافینی تهیه خواهد شد. نمونه های بافتی داخل بلوک قرار خواهند گرفتند. سپس با استفاده از میکروتوم، برش های 5 میکرونی جهت تهیه لام از نمونه انجام خواهد گرفت. نمونه ها با روش هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) رنگ آمیزی خواهند شد، سپس نمونه ها ازنظروسعت محل ها ی ارتشاح و شدت ارتشاح لکوسیتی با استفاده از میکروسکوپ oluympus BX51 مورد بررسی قرار خواهند گرفت. برای رنگ آمیزی برش های نخاع با Luxol Fast Blue (LFB)، لام های تهیه شده از نخاع پس از شفاف سازی با زایلول و آب دهی با الکل مطلق 95% حاوی LFB 1% به مدت 3 ساعت در حمام آبی رنگ آمیزی خواهند شد. وسعت ناحیه دمیلینه شده در هر گروه با نرم افزار infinity محاسبه خواهد شد. جهت انجام ایمونوهیستوشیمی، برش های بافتی با PBS شستشو داده شده و در بافر نمک تریس با 25/.% تریتون X-100 حاوی پراکسید هیدروژن 3/.% انکوبه خواهد شد. مرحله بعد افزودن آنتی بادی های منوکلونال موشی می باشد که شاملMouse anti-IFN-γ و Mouse anti-IL-17 میباشد. پس از انکوباسیون و شستشو، آنتی بادی های ثانویه نشاندار با مواد فلورسنت، Goat anti-mouse افزوده شده و انکوباسیون صورت میگیرد. در نهایت لام ها با بافر گلیسرول پوشیده شده و بعد از گذاشتن لامل با میکروسکوپ فلورسنت بررسی خواهند شد. در مرحله بعد طحال موش ها تحت شرایط استریل خارج و بعد از قطعه قطعه شدن در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10% FBS له خواهد شد. بافت حاصل جهت تهیه سوسپانسیون سلولی از توری سیمی عبور داده و سانتریفیوژ خواهد شد. به منظور حذف گلبول های قرمز، بافر لیز کننده اضافه و سانتریفوژ خواهد شد. رسوب سلولی در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10% FBS به حالت سوسپانسیون در خواهد آمد. پس از شمارش سلولی، سلول ها در پلیت های کشت 24 خانه در حضور پپتید MOG به مدت 72 ساعت در انکولاتور حاوی 5% CO2 کشت داده خواهند شد. پس از این مدت مایع رویی جمع آوری شده و جهت سنجش سایتوکاین ها از جمله ، IL-17A، IL-10، IFN-γ و با استفاده از کیت های الایزای مربوطه و طبق دستورات مندرج انجام خواهد گرفت. در مرحله بعد از جداسازی نخاع از 5 گروه موشهای EAE دریافت کننده DMF و Ruxolitinib ، گروه موشهای دریافت کننده درمان ترکیبی و گروه کنترل، بافت ها به صورت هموژنات در آورده می شوند. جهت بررسی میزان بیان فاکتورهای نسخه برداری T-bet، IFN-γ، IL-17، GATA3، IL-21، IL-23R، Foxp3، RoRγt و IL-6R از روش Quantitative Real time PCR استفاده می شود. به گونه ای که ابتدا با استفاده ازTrizol اقدام به استخراج تمامی RNAهای موجود در سلول ها کرده و در ادامه با استفاده از پرایمر اختصاصی اقدام به تولید cDNA از ژن مورد نظر کرده و با استفاده از پرایمر اختصاصی ژن و رنگSYBR Green ، که یک رنگ اینترکاله شونده با DNA دو رشته ای است،cDNA سنتز شده از روی ژن مذکور را در دستگاه ترموسیکلر تکثیر داده و با گروه کنترل مقایسه می شوند. لازم به ذکر است که جهت نرمالایز کردن اندازه گیری ژن های مذکور از β- اکتین به عنوان House Keeping gene استفاده می شود. ارزیابی فاکتورهای نسخه برداری T-bet، IFN-γ، IL-17، GATA3، RoRγt، IL-21، IL-23R، Foxp3 و IL-6R براساس میزان فلورسانس تولید شده از رنگ مذکور صورت می گیرد.