تولید و ارزیابی داربست آسلولار بارگذاری شده با ماده P, قبل و بعد از کشت سلول های بنیادی مشتق از چربی

مجریان: لیلا روشنگر

خلاصه روش اجرا: در این مطالعه قسمتی از روده باریک گوسفند را تهیه کرده و در آزمایشگاه اقدام به پاک سازی محتویات آن می نماییم. با توجه به اینکه تنها ماتریکس خارج سلولی بافت برای ما حائز اهمیت می باشد در وهله اول جداسازی مکانیکی انجام داده و لایه های سروزی,عضلانی و مخاطی را از بین می بریم. ساختار زیر مخاط باقی مانده حاوی مقداری چربی می باشد فلذا به دلیل ایجاد اختلال در مراحل بعدی, عمل چربی زدایی را با بکار گیری محلولی از متانول و کلروفرم انجام می دهیم. مرحله بعدی مرحله هضم آنزیمی می باشد که بوسیله تریپسین 05/0% صورت خواهد گرفت. پس از انجام مراحل شستشو و استریل سازی و در نهایت حذف حداکثری سلول های بافت, قسمت باقی مانده بیانگر اسکافولد آسلولار می باشد. جهت حصول اطمینان از کامل بودن فرایند آسلولاریزاسیون و تعیین بقایای هسته سلول, رنگ آمیزیDAPI و هماتوکسیلین-ائوزین انجام داده و ویژگی های ظاهری سلول ها را مورد مطالعه قرار خواهیم داد. اسکافولد آسلولار تهیه شده تحت بخار گلوتار آلدئید به وسیله mineral pitch لود گردیده و سپس سلول های بنیادی استخراج شده از بافت چربی را بر روی آن کشت می دهیم. میزان کلاژن موجود در اسکافولد را بوسیله رنگ آمیزی هیستولوژیکی بررسی می نماییم. در ادامه خصوصیات ماتریکس داربست پس از کشت سلول های بنیادی اعم از میزان استحکام داربست و میزان چسبندگی سلول ها بر روی داربست مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت که برای این منظور دوباره رنگ آمیزی H&Eو DAPI صورت خواهد گرفت و با استفاده از روش های تصویر برداری با میکروسکوپ معکوس و نیز میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ مشاهدات را جهت مقایسه ارزیابی ثبت خواهیم کرد. میزان توکسیسیتی داربست نیز با روش MTT assay مورد بررسی قرار خوهد گرفت. در ادامه جهت مشخص نمودن میزان بیان ژن های SDF1_alfaوHMGB1 در داربست تهیه شده,از تکنیکRT-PCR استفاده خواهد شد.