تاثیر سربرولایزین بر میزان بیان TLR2, TLR4 با مسیر NF-KB به دنبال مصرف مزمن الکل در موش های صحرائی نر

مجریان: سیامک صندوقچیان

خلاصه روش اجرا: 70 موش صحرایی ) Wister 220تا 250 گرم) از واحد حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی تبریز خریداری خواهد شد و با توجه به راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات بر اساس کمیته اخلاق منطقه ای دانشگاه علوم پزشکی تبریز موش ها به صورت دوتائی در دمای ℃ 21 ± 2 و در یک چرخه روشن / تاریک 12 ساعت (نور در ساعت 8:00 صبح) قرار می گیرند. غذا و آب در دسترس خواهد بود. حیوانات به صورت تصادفی به گروه های زیر تقسیم می شوند: 1- گروه کنترل: این گروه طی 28 روز متوالی از راه خوراکی نرمال سالین را به میزان 5 میلی لیتر به ازای هر کیلوگرم وزن بدن از راه خوراکی و با استفاده از تیوب گاواژ دریافت می کند. سپس بعد از پایان روز بیست و هشتم، از روز بیست و نهم و به بعد نرمال سالین با همان میزان اولیه از راه داخل صفاقی به مدت بیست و هشت روز دیگر تجویز خواهد شد. 2- گروه الکل: این گروه طی 28 روز متوالی از راه گاواژ داخل معده ای اتانول (99.9%, absolute, Merck ) را به میزان (4گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) دریافت خواهند کرد. در این روش، غلظت اولیه اتانول 5 درصد (v / v) خواهد بود و پس از آن 5 درصد اتانول هر 2 روز برای رسیدن به غلظت نهایی 20 درصد (v / v) به مقدار اولیه اضافه خواهد شد. تجویز این غلظت از اتانول برای 22 روز باقی مانده مطالعه ادامه خواهد داشت. بر اساس مطالعات این پروتکل قادر خواهد بود تا اتانول را به حداکثر غلظت خونی خود یعنی در حدود 99 میلی گرم در دسی لیتر برساند (28و29). در ادامه این گروه بعد از روز بیست و هشتم و به دنبال پایان تجویز مزمن اتانول از روز بیست نهم و به بعد به مدت 28 روز از راه داخل صفاقی نرمال سالین را به میزان 5 میلی لیتر به ازای هر کیلوگرم وزن بدن دریافت خواهد کرد. 3- الکل + دوز پایین سربرولایزین: در این گروه، اتانول همانند گروه شماره 2 از راه خوراکی و با همان پروتکل و دوز به مدت 28 روز متوالی تجویز می شود. بعد از این مدت تجویز الکل متوقف شده و از روز بیست و نهم، موشهای صحرائی الکلی شده، به مدت 28 روز متوالی از راه داخل صفاقی سربرولایزین را با دوز 1 میلی لیتر به ازای هر کیلوگرم وزن بدن دریافت می کنند [30]. 4- الکل + دوز متوسط سربرولایزین: در این گروه، اتانول همانند گروه شماره 2 از راه خوراکی و با همان پروتکل و دوز به مدت 28 روز متوالی تجویز می شود. بعد از این مدت تجویز الکل متوقف شده و از روز بیست و نهم، موشهای صحرائی الکلی شده، به مدت 28 روز متوالی از راه داخل صفاقی سربرولایزین را با دوز 5/2 میلی لیتر به ازای هر کیلوگرم وزن بدن دریافت می کنند [31]. 5- الکل + دوز بالای سربرولایزین: در این گروه، اتانول همانند گروه شماره 2 از راه خوراکی و با همان پروتکل و دوز به مدت 28 روز متوالی تجویز می شود. بعد از این مدت تجویز الکل متوقف شده و از روز بیست و نهم، موشهای صحرائی الکلی شده، به مدت 28 روز متوالی از راه داخل صفاقی سربرولایزین را با دوز 5 میلی لیتر به ازای هر کیلوگرم وزن بدن دریافت می کنند [32]. غلظت الکل خون نمونه های خون از دم، 2 ساعت بعد از آخرین دوز مصرف الکل گرفته خواهد شد و میزان الکل خون (BAC) با استفاده از یک کیت تشخیصی مبتنی بر الکل دهیدروژناز استاندارد ، (Abcam UK) تعیین می شود. اندازه گیری وزن بدن وزن بدن در هر حیوان مورد مطالعه هر هفته بررسی می شود تا بتواند هر گونه تغییری را در این پارامتر تشخیص دهد. تعیین میزان بیان TLR2وTLR4 تعیین میزان تغییرات بیان TLR2و TLR4 تحت تاثیر تجویز طولانی مدت سربرولایزین هم در کبد موشهای صحرائی دریافت کننده اتانول و هم در سلولهای کوپفر در بافت کبد، با استفاده از تکنیک Real Time PCR انجام خواهد شد. بدین منظور ابتدا موشهای صحرائی ابتدا با مخلوطی از دوز بالای کتامین و زایلازین ( 100 و 10 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) به طور عمیق بی هوش شده [ 33]و پس از برش دادن ناحیه شکم حیوان، کبد استخراج خواهد شد. سپس، سلولهای کوپفر با به کار گرفتن آنزیم کلاژناز I با غلظت ده درصد استخراج شده و در محیط کشت سلولی 1640 به همراه اریترومایسین یک درصد کشت خواهد شد. در این روش، با استفاده از روش تریزول (Trizol)، mRNA سلولی استخراج خواهد شد. سپس از این سلول ها نیز میزان بیان TLR2 و TLR4 از تکنیک Real Time PCR (corrbet,USA) انجام خواهد شد. تعیین مکانیسم اثر برای تعیین تغییرات فعالیت مسیر NF-κB در گرووهای مختلف، از آنتی بادی های علیه NF-κB و با استفاده تکنیک وسترن بلات انجام خواهد گرفت.