بررسی اثر نانوذرات بارگیری شده با مولکول های siRNA ضد P68 و STAT3 در مهار رشد و گسترش سلول های سرطانی
Investigation of the effect of nanoparticeles loaded with the siRNA molecules against P68 and STAT3 in the growth inhibition and development of cancer cells.
مجریان: بهزاد برادران , فرهاد جدیدی نیارق
خلاصه روش اجرا: این مطالعه دو فاز دارد: ۱.تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات حاوی siRNA : ابتدا با واکنش کیتوزان و اسید لاکتیک ترکیب کیتوزان لاکتات را تولید می کنیم. سپس باید نانوذرات کیتوزان لاکتات RNA مداخله گر را در بر بگیرند. کیتوزان لاکتات پتانسیل بالایی برای کپسوله کردن siRNA و حفاظت از آن در برابر تخریب سرمی دارد. تشکیل نانو ذرات کیتوزان لاکتات در اثر تعاملات یونی بین کیتوزان لاکتات و siRNA حل شده در سدیم تری پلی فسفات ( siRNA/TPP ) صورت می گیرد و نانوذرات حاوی siRNA تولید می شوند که خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن ها بررسی می شود. تولید کمپلکس نانوذرات-siRNA با ژل الکتروفورز در ژل 2% آگارز تایید می شود و میزان بارگیری siRNA به صورت کمی به وسیله روش اولتراسانتریفیوژ بررسی خواهد شد. ۲. مطالعه in vitro اثر بخشی نانو ذرات تهیه شده : از رده های سلول های سرطانی موشی 4T1 (سرطان پستان) و CT26 (سرطان کلون) در این مطالعه استفاده خواهد شد که مطالعات گذشته بیانP68 و تولید اینترلوکین 6 و اینترلوکین 33 توسط آن ها را اثبات کرده است و میزان بیان آن ها نیز در هر رده سلولی متفاوت است. همچنین مطالعات زیادی نشان داده است P68 در سلول های سرطانی در مقایسه با بافت های نرمال این سلول ها در چندین جایگاه تیروزین فسفریله می باشد در واقع P68 فسفریله با تکثیر بی رویه و توموری شدن بافت های نرمال مرتبط می باشد[1]. این رده های سلولی در محیط RPMI1640 حاوی 10% FBS و آنتی بیوتیک کشت داده می شوند. پس از گذشت ۲۴ ساعت از کشت سلولی نانوذرات حاوی siRNA را به محیط کشت هر رده سلولی اضافه می کنیم. میزان تاثیر نانوذرات بارگیری شده با siRNA بر روی بیان ژن P68 و STAT3 و IL-6 و IL-33 در کشت سلول ها توسط تکنیک Real-time PCR و ELISA( در سوپ رویی) در فواصل زمانی مختلف بررسی می شود. تاثیر نانوذرات حاوی siRNA بر روی حیات سلولی توسط آزمونMTT ارزیابی می شود. علاوه بر این میزان تاثیر نانوذرات بارگیری شده با siRNA بر روی فاکتورهای موثر برای انکوژنسیته نظیر فاکتور های موثر در تقویت تکثیر سلولی ,Cyclin D1, β-catenin Mcl-1 و فاکتور ضد آپوپتوز نظیرBcl-xl و فاکتور های پیش آپوپتوزی Bax و فاکتور های موثر در آنژیوژنز VEGF و فاکتور های موثر در متاستاز تومور نظیر vimentin Snail2, fibronectin, MMP-2 , MMP-9 , با استفاده از تکنیک Real-time PCR و تست آپوپتوز به روش فلوسایتومتری با استفاده از کیت آنکسین v در فواصل زمانی مختلف بررسی می شود، همچنین میزان تاثیر نانوذرات بارگیری شده با مولکول های siRNA بر روی مهاجرت سلولی در کشت سلول ها توسط تکنیک Gap Closure Migration Assays در فواصل زمانی مختلف بررسی می شود.
اطلاعات کلی طرح 
| مرحله جاری طرح | خاتمه قرارداد و اجرا |
| کد طرح | 59121 |
| عنوان فارسی طرح | بررسی اثر نانوذرات بارگیری شده با مولکول های siRNA ضد P68 و STAT3 در مهار رشد و گسترش سلول های سرطانی |
| عنوان لاتین طرح | Investigation of the effect of nanoparticeles loaded with the siRNA molecules against P68 and STAT3 in the growth inhibition and development of cancer cells. |
| نوع طرح | طرح - پایان نامه |
| اولویت طرح | سیستم های نوین دارورسانی |
| نوع مطالعه | مطالعات علوم پایه (Experimental) |
| تحقیق در نظام سلامت | بلی |
| آیا طرح پایاننامه دانشجویی است؟ | بله |
| مقطع پایان نامه | دکتری تخصصی PhD |
| مدت اجرا - ماه | 18 |
| نوآوری و ضرورت انجام تحقیق | مطالعات نشان می دهد P68 یک RNAهلیکاز می باشد و در سلول های سرطانی در مقایسه با بافت های نرمال آن ها در چندین جایگاه تیروزین فسفریله می باشد در واقع فسفریلاسیون P68 با انکوژنسیته بافت های نرمال مرتبط می باشد [1]. همچنین به عنوان فعال کننده چندین فاکتور رونویسی مرتبط با انکوژنسیته می باشد مانند بتا کاتنین و STAT3 که متعاقبا باعث افزایش بیان ژن های مورد هدف STAT3 می شود، STAT3 به عنوان یکی از کاندیدهای امید بخش برای درمان سرطان محسوب می شود با توجه به ارتباطی که بین P68 و STAT3 وجود دارد، می توان گفت P68 به عنوان تقویت کننده سطح mRNA و پروتئین ژن های مورد هدف STAT3 در سرطان کلون و پستان عمل می کند که برای افزایش تکثیر سلولی، بقا و آنژیوژنز و تهاجم سلولی لازم است، لذا p68 به عنوان یک فعال کننده جدید STAT3 می تواند یک هدف درمانی قوی تر در نظر گرفته شود، به عبارت دیگر p68 در راستای STAT3 به ناحیه GAS (توالی فعال شده توسط اینترفرون گاما) در پروموتور ژن های هدف STAT3 متصل می شود و تقویت کننده بیان ژن های وابسته به STAT3 می باشد[2]. همچنین مطالعات نشان می دهد اینترلوکین6 و اینترلوکین 33 از سایتوکاین های غالب ریزمحیط تومورها می باشد و توسط رده های سلول های سرطانی موشی 4T1 (سرطان پستان) و CT26 (سرطان کلون) نیز تولید می شود موجب رشد و تکثیر، بقا، تهاجم، متاستاز، رگزایی و مقاومت دارویی تومور می شود[3-6]. اکثر این اعمال با فعال شدن فاکتور رونویسی STAT3 القا می شود. مطالعات جداگانه زیادی برای مهار STAT3 صورت گرفته است با توجه به این که همه آن ها به صورت سیستمیک بوده اند عوارض جانبی زیادی داشتند. از طرفی امکان استفاده از RNAهای مداخله گر به طور مستقیم در موجودات زنده وجود ندارد. در این مطالعه ما به کمک نانوذرات و RNAهای مداخله گر به دنبال معرفی روشی هدفمند هستیم که بیان ژن های P68 و STAT3 را هم زمان در ریزمحیط توموری سرکوب کند و با دوز کم، بیشترین تاثیر و کمترین عارضه را داشته باشد. علاوه براین، با کمک نانو ذرات امکان استفاده از RNAهای مداخله گر در موجود زنده و هم امکان دارو رسانی هدفمند وجود خواهد داشت که مقصود مطالعات آینده ما در مدل حیوانی خواهد بود. |
| اهداف اختصاصی | هدف اختصاصی شماره1 : تولید نانو ذرات کیتوزان لاکتات حاوی siRNA : -برای مقایسه آماری نتایج بیان ژن، بسته به نوع توزیع داده ها (نرمال یا غیرنرمال) از آزمون های آماری Student t test یا Mann-Whitney U استفاده خواهد شد. |
| چکیده انگلیسی طرح | غهغهغهThis study has two phases: 1. Production of chitosan lactate nanoparticles containing siRNA: First, we produce the chitosan lactate compound by reacting chitosan and lactic acid. Then, the chitosan lactate nanoparticles should encapsulate the interfering RNA. Chitosan lactate has a high potential for encapsulating siRNA and protecting it against serum degradation. The formation of chitosan lactate nanoparticles occurs due to ionic interactions between chitosan lactate and siRNA dissolved in sodium tripolyphosphate (siRNA/TPP), and nanoparticles containing siRNA are produced, and their physicochemical properties are investigated. The production of nanoparticle-siRNA complexes is confirmed by gel electrophoresis in 2% agarose gel, and the amount of siRNA loading will be quantitatively investigated by ultracentrifugation. 2. In vitro study of the effectiveness of the prepared nanoparticles: The mouse cancer cell lines 4T1 (breast cancer) and CT26 (colon cancer) will be used in this study, which previous studies have proven the expression of P68 and the production of interleukin 6 and interleukin 33 by them, and their expression levels are also different in each cell line. Also, many studies have shown that P68 is phosphorylated at several tyrosine sites in cancer cells compared to normal tissues of these cells. In fact, phosphorylated P68 is associated with uncontrolled proliferation and tumorigenesis of normal tissues [1]. These cell lines are cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS and antibiotics. After 24 hours of cell culture, nanoparticles containing siRNA are added to the culture medium of each cell line. The effect of siRNA-loaded nanoparticles on P68, STAT3, IL-6, and IL-33 gene expression in cell culture is investigated by Real-time PCR and ELISA (in supernatant) at different time intervals. The effect of siRNA-loaded nanoparticles on cell viability is evaluated by MTT assay. In addition, the effect of siRNA-loaded nanoparticles on factors effective for oncogenicity, such as factors effective in enhancing cell proliferation, Cyclin D1, β-catenin Mcl-1, and anti-apoptotic factors such as Bcl-xl, pro-apoptotic factors Bax, and factors effective in angiogenesis VEGF, and factors effective in tumor metastasis, such as vimentin Snail2, fibronectin, MMP-2, and MMP-9, is investigated using Real-time PCR technique and apoptosis test by flow cytometry using Annexin V kit at different time intervals. Also, the effect of nanoparticles loaded with siRNA molecules on cell migration in cell culture is investigated using Gap Closure Migration Assays technique at different time intervals. |
| کلمات کلیدی | RNA مداخله گر (RNAi): اصطلاح کلی است که به تکنولوژی خاموشی پس از رونویسی توسط RNA دو رشته ای اطلاق گردیده و در گیاهان با اصطلاح PTGS عنوان می شود .در تکنولوژی RNA مداخله گر (RNAi) ، رشته مکمل mRNA ژن مورد نظر ساخته شده و این رشته به mRNA ژن هدف متصل و یک توالی دورشته ای (dsRNA) را بوجود می آورد. از آنجا که سیستم سنتز پروتئین قادر به ترجمه mRNA دو رشته ای نمی باشد، بیان ژن هدف متوقف و اصطلاحاً ژن خاموش می شود. کیتوزان : کیتوزان یک آمینو پلی ساکارید خطی و ترکیبی از پیوند های (۴→۱ β) واحدهای D-گلوکزآمین وN-استیل -D-گلوکزآمین است. کیتوزان توسط داستیلاسیون کیتین ( پلی ساکارید طبیعی و فراوان موجود در اسکلت خارجی سخت پوستانی همچون خرچنگ و میگو)، تهیه می شود. این پلی ساکارید کاتیونی به دلیل دسترس پذیری فراوان، چسبندگی بی نظیر، خواص دارویی مناسب و دیگرخواص سودمند بیولوژیکی مثل زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری، عدم سمیت و تحریک کم سیستم ایمنی، در موارد بیوپزشکی و دارویی مورد توجه گسترده قرارگرفته است. P68 یا DDX5: P68 یک RNA هلیکاز عضو از خانواده DEAD box می باشد دارای فعالیتATPase و فعالیت بازکنندگی پیچ RNA را دارد در تنظیم رونویسی و تعمیر DNA و همچنین در پدیده splicing Pre mRNA ( پیرایش) و در تکثیر و تکامل سلولی نقش بسیار مهمی دارد. STAT3 : یکی از اعضای خانواده STAT است که توسط ژن STAT3 تولید می شود. در سیتوپلاسم به صورت مونومر های غیر فعال وجود دارند که در پاسخ به سایتوکین ها و فاکتور های رشد توسط JAK فسفریله شده و تشکیل همودایمر می دهند و به هسته نقل مکان کرده و با اتصال به توالی های خاص نسخه برداری ژن های مربوطه را تحریک می کنند. MDSC: از سلول های رده میلوئیدی است که موجب مهار پاسخ های ایمنی می شود. IL-6 : اینترلوکین ۶ یکی از سایتوکاین های مهم سیستم ایمنی است که در پاسخ به میکروب ها و سایر سایتوکین ها مثل TNF و اینترلوکین ۱ توسط فاگوسیت های تک هسته ای ، اندوتلیال عروق ، فیبروبلاست ها و سلول های Tفعال تولید می شود و هم در ایمنی ذاتی و هم ایمنی اکتسابی نقش دارد. IL-33: اینترلوکین 33 یکی از سایتوکاین های از خانواده IL-1 که از بافت های تحت استرس و آسیب دیده به عنوان یک علامت خطر آزاد می شود و توسط اندوتلیال و اپی تلیال بصورت کامل تولید می شود بر خلاف IL-1β و IL-18 در صورت برش خوردن غیر فعال می شود جز پاسخ های نوع دو محسوب می شود. EMT: به عنوان شروع کننده تهاجم و متاستاز تومور می باشد و توسط ژن های Snail1و Vimentin و Fibroectin می تواند آغاز شود. EPR : ویژگی افزایش و نفوذ پذیری و نگهداری بافت توموری بر اساس دو خصوصیت بافت توموری است 1- اندوتلیال مویرگ در بافت بدخیم ، نامنظم تر از بافت های سالم است و نفوذ پذیری بالاتری به ماکرومولکول ها دارد. این امر امکان خروج نانوذرات حامل دارو از رگ های را در انوتلیال تومور فراهم می کند. 2- عدم وجود تخلیه لنفاوی در بستر تومور منجر به گیر افتادن دارو در این ناحیه می شود لذا نانوذره حامل ارو می تواند تجمع دارو ر بافت هف را به میزان 100-10 برابر نسبت به داروی آزاد افزایش هد. متاستاز (Metastasis) : به گسترش و مهاجرت سلولهای سرطانی از یک بافت به بافتهای دیگر، متاستاز گفته میشود. آنژیوژنز (Angiogenesis) : فرایندی فیزیولوژیکی است که در آن رگ های جدید از رگهای موجود رشد میکنند. ایجاد رگهای خون رسان در درون تومورها برای آن ها حیاتی است. نانوذره (Nanoparticle) : ذراتی هستند که ابعاد آنها در حدود ۱ تا ۱۰۰ نانومتر است. لیپوزمها، درخت سانها، نانو ذرات پلیمری، نانو ذرات پوشش داده شده با پلیمرها، نانو ذرات کیتوزان و لستین و نانو ذرات دارویی نمونههایی از نانو ذراتی میباشند که برای دارو رسانی استفاده شده اند. |
| ذینفعان نتایج طرح | عمدتا بیمارانی که از درمان سرطان به شیوه های قبلی نظیر نظیر جراحی، شیمی درمانی و رادیوتراپی به علت اثرات جانبی این داروها و عود مجدد سرطان ناخوشایند می باشند، به ویژه برای سرطان های متاستاز دهنده درمان های موجود ناکامل می باشند. |
اطلاعات مجری و همکاران
| نام و نامخانوادگی | سمت در طرح |
|---|---|
| بهزاد برادران | استاد راهنمای اول (آموزشی ) |
| فرهاد جدیدی نیارق | استاد راهنما دوم (آموزشی ) |
| جعفر مجیدی ذوالبین | مشاور |
| فاطمه اطیابی | مشاور |
| امیر علی مختارزاده | همکار اصلی |
| ویدا هاشمی | دانشجوی مالک پایان نامه |
| محمد حجت فرسنگی | همکار اصلی |
اطلاعات تفضیلی
| حوزه خبر | خبر |
|---|---|
| رسانه ها و مردم | عنوان خبر مهار ترکیبی مولکول های P68 و STAT3 مانع گسترش و انتشار سلول های سرطانی می گرددمتن خبر آنژیوژنز و متاستاز اصلی ترین عوامل گسترش و انتشار تومور و نهایتا مرگ بیماران سرطانی می باشد. از اینرو درمان ها موجود بایستی بتوانند این فرآیندها را کنترل نمایند.
بدین منظور در این مطالعه با استفاده از درمان ترکیبی بر پایه مهار دو مولکول مهم درگیر در این زمینه به دنبال مهار این دو فرآیند مهم در رشد تومور بودیم. با توجه به نتایج بدست آمده بنظر می رسد که مهار ترکیبی بیان مولکول های P68 و STAT3 در رده های سلولی سرطانی مختلف شامل سرطان سینه (4T1) و سرطان کولون (CT26) و ملانوما (B16) بوسیله نانوذرات بارگیری شده با مولکول های siRNA می تواند با سرکوب بیان این کولکول های مانع از رشد و گسترش این سلول ها گشته و با مهار مولکول های درگیر در آنژیوژنز و متاستاز موجب مهار گسترش و انتشار تومور گردد.
با توجه با نتایج حاصله تجاری سازی واکسن نانو تولیدی در این مطالعه می تواند در آینده کمک بزرگی به بخش صنعت و درمان نماید. |
| متخصصان و پژوهشگران | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران درمانی | عنوان خبر متن خبر |
| سیاستگذاران پژوهشی | عنوان خبر مهار ترکیبی مولکول های P68 و STAT3 مانع گسترش و انتشار سلول های سرطانی می گرددمتن خبر آنژیوژنز و متاستاز اصلی ترین عوامل گسترش و انتشار تومور و نهایتا مرگ بیماران سرطانی می باشد. از اینرو درمان ها موجود بایستی بتوانند این فرآیندها را کنترل نمایند.
بدین منظور در این مطالعه با استفاده از درمان ترکیبی بر پایه مهار دو مولکول مهم درگیر در این زمینه به دنبال مهار این دو فرآیند مهم در رشد تومور بودیم. با توجه به نتایج بدست آمده بنظر می رسد که مهار ترکیبی بیان مولکول های P68 و STAT3 در رده های سلولی سرطانی مختلف شامل سرطان سینه (4T1) و سرطان کولون (CT26) و ملانوما (B16) بوسیله نانوذرات بارگیری شده با مولکول های siRNA می تواند با سرکوب بیان این کولکول های مانع از رشد و گسترش این سلول ها گشته و با مهار مولکول های درگیر در آنژیوژنز و متاستاز موجب مهار گسترش و انتشار تومور گردد.
با توجه با نتایج حاصله تجاری سازی واکسن نانو تولیدی در این مطالعه می تواند در آینده کمک بزرگی به بخش صنعت و درمان نماید. |
| لینک (URL) مقاله انگلیسی مرتبط منتشر شده 1 |
