طراحی و تهیه کیت استخراج میتوکندری از سلولهای کشت داده شده و بافت ها

مجریان: مهدی مهدی پور

خلاصه روش اجرا: میتوکندری بعنوان یکی از اجزای مهم سلولی، نقش اجتناب ناپذیری را در تولید انرژی سلولهای بدن از طریق فسفریلاسیون اکسیداتیو به صورت پیوندهای پر انرژی فسفات (ATP) و گلیکولیز ایفا می کند. با توجه به اهمیت این موضوع مطالعات گسترده ای برای شناخت بیشتر این عضو فعال سلولی در حال انجام می باشد. امروزه از این ارگانل سلولی برای مصارف درمانی نیز استفاده می گردد. نخستین گام در این زمینه استحصال میتوکندری با حداقل دستکاری و ایجاد خدشه به ماهیت آن می باشد. در این طرح ما برآن هستیم تا با استفاده از دانش جمعی و بهره گیری از جدیدترین یافته های علمی فرایند استخراج میتوکندری را تثبیت و در قالب یک کیت منسجم ارایه نماییم. طی این فرایند استخراج میتوکندری از نمونه های مختلفی از جمله: بافت عضله قلبی و اسکلتی، چربی، مغز، کبد، تخمدان، بیضه، خون، اسپرم و چندین رده سلولی استفاده خواهد شد. پروتکل مورد نظر شامل سه مرحله کلی خواهد بود. در مرحله نخست بافتهای مورد نظر پس از شستشو بوسیله بافر شستشو (PBS )، توسط فشار فیزیکی(Pastel-mortar) به تکه های کوچکتر تقسیم خواهند شد. سپس با استفاده از بافر نمکی تشکیل شده از NaCl و MgCl2 سلولها متورم شده و با استفاده از بافر تشکیل شده از manitol, sucrose, Tris-HCL و EDTA و هموژنایزر دونس فرایند همگن سازی انجام خواهد شد. توسط سرعت¬های مختلف سانتریفیوژ، هسته، دیواره سلولی و سلولهایی که منهدم نشده اند از سایر اجزای سلولی که غالبا میتوکندری هستند جدا خواهند شد. در بخش شستشو مجددا از بافرهای حاوی manitol, sucrose, Tris-HCL و EDTA استفاده شده و در نهایت میتوکندری خالص جمع آوری خواهد شد. جهت بررسی کیفیت میتوکندری استخراج شده از روشهای مختلفی مانند: ارزیابی کیفیت mtDNA، ارزیابی زیست پذیری توسط mito-tracker و rhodamine ، ارزیابی سایز میتوکندری از طریق DLS همچنین از میکروسکوپ الکترونی برای بررسی مورفولوژی میتوکندری استفاده خواهد شد. پس از تایید نهایی و تکرار آزمایش بصورت مستقل، محصول خروجی این پروژه در قالب کیت استخراج میتوکندری از طیف وسیعی از بافتها برای اهداف گوناگون تحقیقاتی و بالینی ارائه خواهد شد. کیتهای مختلفی برای استخراج میتوکندری معرفی شده اند که شامل: o Qproteum mitochondria isolation kit (Qiagen, USA) o MITOISO2 mitochondria isolation kit (Sigma, USA) o Mitochondria Isolation Kit, (human, Miltenyi Biotec GmbH, Germany ) می باشد.