تهیه و ارزیابی invitro خواص ضد سرطانی نانوذرات پلیمری برپایه PLGA-PEG حاوی تراپوکسین A و متوترکسات بروی سلولهای سرطانی سینه MCF-7

مجریان: عفت علیزاده , ابوالفضل اکبرزاده

خلاصه روش اجرا: تهیه نانوذرات پلیمری PLGA و بارگذاری داروی متوترکسات و تراپوکسین A در آنها و مشخصه یابی آنها الف-ساخت پلیمر قابل فرسایش PLGA-PEG پلی اتیلن گلیکول (PEG4000) با تقطیر آزئوتروپیک با تولوئن در زیر اتمسفر نیتروژن (3 مرتبه هربار با ml50 تولوئن) و سپس خشک کردن در داخل دسیکاتور شیشه ای متصل به پمپ خلاء (130 درجه سانتیگراد و 5 میلی متر جیوه) خالص سازی خواهد شد. مونومرهای لاکتید و گلیکولید با نسبت مولی 3 به 1، پلی اتیلن گلیکول و اکتوات قلع (05/0)درصد وزنی) به یک بالون متصل به ورود و خروج نیتروژن افزوده خواهند شد در نهایت پس از خالص سازی پلیمر مورد نظر جهت بارگذاری دارو آماده سازی می شود متغیرهای مورد بررسی: ساختمان کوپلیمر-نسبت مولی مونومرها در پلیمر-جرم مولکولی پلیمر- رفتار حرارتی پلیمر ب-نانوانکپسولاسیون داروی متوترکسات و تراپوکسین A نانوپارتیکل های بدون حضور دارو (بلانک حاوی 10% وزنی پلیمر و 0% دارو) ویا بارگذاری شده با  داروی متوترکسات و تراپوکسین A ( با درصد لودینگ تئوریک 1-5%) با استفاده دو روش امولسیون اصلاح شده روغن در آب (O/W) و امولسیون دوگانه W/O/W تهیه خواهند شد. در حالت بدون دارو پلیمر( با درصد وزنی 10%) در دی کلرو متان حل خواهد شد. در حالت همراه با دارو، پس از حل شدن پلیمر مورد نظر در دی کلرومتان ابتدا داروی تراپوکسین آ به محلول پلیمری اضافه و هموژنیزه شده و پس از آن متوتروکسات به این محلول اضافه می شود وفاز آلی به محلول آبی حاوی امولسیفایر PVA(1% وزنی-حجمی)افزوده شده و در یک هموژنایزر ( Edmund Buhler HO 4AP, 10000 rpm, 3Í10 s) در حمام یخ بهمزده خواهد شد. حلال آلی به سرعت در اثر تبخیر در فشار کم حذف خواهد شد. پارتیکل ها به وسیله الترا سانتریفوژ Beckman, Optima, TLX, 24000Íg) (جدا شده و لیوفلیزه خواهند گردید (Christ Alpha, USA). در روش امولسیون دوگانه پلیمر در حلال آلی و نمک دارو در حلال آبی داخلی حل شده و امولسیون اولیه به روش هموژنیزاسیون تهیه شده و به محلول آبی دوم حاوی پایدار کننده PVA اضافه خواهد شد و امولسیون دوم به دست خواهد آمد ج-تعیین خواص فیزیکو شیمیایی نانو پارتیکلهای حاوی داروی متوترکسات و تراپوکسین A بهره انکپسولاسیون (EE%) به صورت نسبت مقدار داروی انکپسوله شده به مقدار دارویی که برای تهیه نانوپارتیکل ها مورد استفاده قرار گرفته بود محاسبه خواهد شد. برای تعیین مقدار داروی متوترکسات و تراپوکسین A بارگذاری شده در نانوپارتیکل ها mg3 از نانوپارتیکل ها در ml1 دی کلرومتان حل شدند. مخلوطی از استونیتریل ـ آب دیونیزه (1:1) به محلول دی کلرومتان اضافه شده و با جریان گاز ازت، دی کلرومتان تبخیر گردید،. مقدار داروی متوترکسات و تراپوکسین A در محلول زلال حاصل به روش اسپکتروفوتومتری (Shimadzu 160)UV در طول موج ماکسیمم تراپوکسین آ  254نانومتر و در طول موج ماکسیمم متوتروکسات که 303 نانومتر است اندازه گیری خواهد شد. در صورتی که جذب دو دارو با هم تداخل داشته باشد از HPLC استفاده خواهد شد. مورفولوژی و اندازه ی ذرات بوسیله میکروسکوپ الکترونی (SEM) و ساختارهای شیمیایی پلیمر به تنهایی و بعد از بارگذاری دو دارو توسط FT-IRمورد بررسی قرار خواهدگرفت. در این مطالعه هدف مطالعه ی جذب فیزیکی داروها در نانو حامل های مورد نظر است که ابتدا دارو ی تراپوکسین آ بارگذاری شده و در مرحله ی دوم متوتروکسات به فاز آلی اضافه شده و انکپسولاسیون انجام میگیرد. در ادامه ی کار سلولهای سرطان سینه MCF-7 از انستیتو پاستور ایران تهیه شده و در محیط کشت RPMIحاوی 10%FBSودر انکوباتور 37 درجه رشد داده خواهد شد.سپس سلولها در پلیت های 96 خانه بذرپاشی می شوند ودر مرحله بعدی داروها به تنهایی و در نانوذرات پلیمری به سلولها اثر داده می شوند در نهایت پس از انکوباسیون مناسب میزان زنده مانی به کمک تست MTT مطالعه می گردد. در ادامه از طریق real time PCR میزان بیان ژن BCL-2 مطالعه می گردد. بعداز بررسی میزان بیان ژن ها با استفاده از تکنیک DAPI و رنگ آمیزی هسته های سلولی میزان آپاپتوز سلول ها را در گروه های مختلف بررسی خواهیم کرد. همچنین برای اطمینان و اثبات صحت کارهای انجام شده با استفاده از FACS میزان مرگ سلولی را با بررسی توقف مراحل  مختلف چرخه ی  سلولی بررسی خواهیم کرد .