تولید آبنبات‌های حاوی نانوذرات تیمول، هل و لاکتوباسیلوس پلانتاروم جهت جلوگیری از رشد استرپتوکوکوس موتانس و کاهش فساد دندان

مجریان: حسین صمدی کفیل

خلاصه روش اجرا: در ابتدا باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم به وسیله روش PCR از پنیر لیقوان جداسازی و تکثیر خواهد شد و سپس مراحل بعدی بر روی آن انجام خواهد گرفت. از آنجاییکه تمامی گروههای جامعه می‌توانند در اجرای این طرح و کاربردهای بعدی آن شرکت کرده و بهره ببرند گروه خاصی از جامعه برای انجام طرح مدنظر نیست و برای اعتبار بیشتر نتایج در هنگام اجرای طرح از افراد با شرایط مشابه تحصیلی و سنی استفاده خواهد شد. در این مطالعه کارآزمایی بالینی تصادفی، 85 نفر به طور تصادفی به 13 گروه مساوی تقسیم خواهندشد. ابتدا حداقل غلظت بازدارندگی تیمول، هل، لاکتوباسیلوس پلانتاروم و نانوذرات حاوی تیمول، هل و لاکتوباسیلوس پلانتاروم در برابر استرپتوکوکوس موتانس به دست خواهد آمد. آبنبات‌های حاوی نانوذرات تیمول، هل و لاکتوباسیلوس پلانتاروم با استفاده از روش محققان قبلی (Holz et al.,2013) تولید خواهد شد. بدین صورت که مواد آبنبات جوشانده شده و پس از سرد شدن مواد ضدمیکرب به مایع آبنبات اضافه خواهد شد. آبنبات‌ها به وزن 5/2 گرم در هشت گروه حاوی هل، تیمول، هل و تیمول و نانوحامل‌های ترکیبات ذکر شده تهیه خواهند شد. گروه اول آبنبات حاوی نانوذرات تیمول، گروه دوم آبنبات حاوی نانوذرات هل، گروه سوم آبنبات حاوی نانوذرات لاکتوباسیلوس پلانتاروم، گروه چهارم آبنبات حاوی نانوذرات تیمول و هل، گروه پنجم آبنبات تیمول و لاکتوباسیلوس پلانتاروم و گروه ششم آبنبات هل و لاکتوباسیلوس پلانتاروم را مصرف خواهند کرد (به مدت سه هفته روزی دو بار هر مرتبه حداقل پنج دقیقه). چهار گروه دیگر هم آبنبات حاوی ماده آزاد هل، تیمول، لاکتوباسیلوس پلانتاروم و هل-تیمول، هل- لاکتوباسیلوس پلانتاروم و تیمول- لاکتوباسیلوس پلانتاروم را به عنوان گروههای شاهد دریافت خواهند کرد. یک گروه نیز آبنبات بدون هیچگونه ماده ضدمیکربی دریافت خواهند کرد. سپس میزان استرپتوکوکوس موتانس و pH بزاق شرکت کنندگان اندازه‌گیری خواهد شد. جداسازی و شناسایی سویه‌ها: با استفاده از سواب نمونه‌های پلاگ جدا شده و هرکدام در ml 1 محیط ترانسپورت حاوی PBS در 2/7=Ph قرار داده شد. هر کدام از نمونه‌ها برای جداسازی استرپتوکو‌های موتانس در محیط جامد بر روی پلیت تلقیح شده و مدت 72 ساعت در 37 در جه سانتیگراد در 10 درصد CO2 گرماگذاری خواهد شد. شناسایی بر اساس آزمون‌های استانداردی مانند شکل کلنی، رنگ آمیزی گرم، فعالیت کاتالازی، رشد در نمک 5/6 درصد، هیدرولیز اسکولین، فعالیت همولیتیکی و تجزیه قندهای لاکتوز- مانیتول- سوربیتول- رافینوز- اینولین، بررسی تولید اسید و تشکیل لخته در اثر رشد در محیط لیتموس میلک، تست VP و هیدرولیز اوره انجام خواهد پذیرفت (حسینی و همکاران،1390). بررسی اثر هل و تیمول بر روی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم: غلظت مناسبی از هل و تیمول با استفاده از محیط کشت مولر¬هینتون آگار تهیه و به داخل پلیت منتقل شده تا آگار سفت خواهد شد. سپس محلول 5/0 مک فارلند باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم روی محیط کشت کشت داده خواهد شد. این پلیت¬ها به مدت 24 ساعت انکوبه شد و رشد یا عدم رشد باکتری بررسی خواهد شد. محیط کشت شاهد نیز به وسیله کشت باکتری لاکتوباسیلوس بر محیط کشت آگار (بدون هل و تیمول) آماده خواهد شد. ﺗﺸﮑﯿﻞ ﺑﯿﻮﻓﯿﻠﻢ: از تک کلنی‌های کشت خالص سویه‌های جدا شده و کنترل (استرپتوکوکوس موتانس) در TYCSB مایع سوسپانسیون میکربی با جذب نوری معادل 1/0 برابر با کدورت استاندارد 5/0 مک فارلند در طول موج 650 نانومتر برای هرنمونه تنظیم خواهد شد. در مرحله بعد هر نمونه (مواد فعال آزاد و کپسوله) و سویه کنترل به میزان 100 میکرولیتر به 6 چاهک موازی در پلیت میکروتیتر 96 چاهکی پلی استیرن افزوده خواهد شد و به عنوان شاهد از محیط مایع TYCSB به همراه 1 درصد ساکارز در یک ردیف 6تایی چاهک استفاده خواهد شد. نمونه‌ها به مدت 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری خواهند شد. سپس محتوی چاهکها به آرامی تخلیه شده و بافر فسفات پتاسیم 01/0 مولار ایزوتونیک با سالین با pH 5/7 استریل به هر چاهک اضافه خواهد شد و تخلیه خواهد گردید. سپس جهت تثبیت به هر چاهک حدود 200 میکرولیتر متانول خالص افزوده و مدت 10 دقیقه در دمای اتاق قرار خواهند گرفت. بعد از تخلیه در مرحله بعد رنگ کریستال ویوله 1 % افزوده خواهد شد و مدت 20 دقیقه در دمای اتاق قرار خواهند گرفت. بعد از تخلیه رنگ و شستشو با آب، اسید استیک گلاسیال 33 درصد حجمی افزوده و با کمک دستگاه الایزا ریدر جذب هر چاهک در طول موج 550 نانومتر قرائت خواهد شد. برای تعیین MIC نیز از روش مایکرو دایلوشن براث پروتکل NCCLS استفاده خواهد شد.