تهیه نانوالیاف بر پایه egg shell membrane به منظور تولید داربست های زیست تخریب پذیر و بررسی عملکرد آنها درمهندسی بافت

مجریان: مهرداد مهکام

خلاصه روش اجرا: خلاصه روش اجرا تهیه نانوالیاف پلیمری egg shell/silk fibroin/PCL 1- 1 استخراج وتهیه ی محلول پلیمرهای طبیعی 1-2 تهیه ی نانوالیاف پلیمری egg shell/silk fibroin/PCL با استفاده از روش الکترواسپینینگ 1- 1استخراج و تهیه ی محلول پلیمرهای طبیعی تخم مرغها شکسته و پوسته ی آنها کاملاً با آب شسته خواهد شد. سپس پوسته ها مدتی در داخل محلول HClغوطه ور خواهد گردید. تا پوسته ی خارجی آهکی براحتی از پوسته ی داخلی جدا گردند. پوسته ی داخلی دست آمده چندین بار با آب شسته خواهد شد، در انتها یکبار هم با استون شسته خواهد شد. پوسته ها در مخلوط محلول آبی مرکاپتوپروپیونیک اسید (1/5 مولار) و اسید استیک با نسبت 90 به 10 در دمای اتاق ریخته شدند. دمای مخلوط به 90 درجه ساننی گراد رسانده خواهد شد و بمدت 12 ساعت در این دما همزده خواهد شد. پس از آن، دمای مخلوط به دمای محیط رسانده شده و توسط سانتریفوژ ذرات معلق حل نشده از محلول جدا خواهد شدند. سپس توسط محلول سود 5 مولار، PH محلول به 5 رسانده شده ورسوب سفید رنگ توسط قیف بوخنر و کاغذ واتمن جداسازی شده و با متانول شسته خواهد شد و در نهایت توسط دستگاه فریزداریر خشک خواهد گردید. ابتدا ابریشم خام اولیه را 2 بار و هر بار حداقل به مدت 30 دقیقه در محلول سدیم بیکربنات و در دمای C°90-100 جوشانده و سپس با آب مقطر گرم چندین مرتبه شستشو داده و فیبرهای ابریشمی حاصل در دمای اتاق خشک خواهد شد.در مرحله ی بعد، فیبرهای ابریشمی حاصله در سیستم حلال 3 جزئی متشکل از آب/اتانول/نمک کلسیم حل شده و در مرحله بعد محلول ابریشم فیلتر و توسط دستگاه فریزدرای خشک خواهد گردید. جامد سفید رنگ اسفنج مانند بدست آمده در یخچال نگهداری خواهد شد. محلولهای w/w) 12% ) از ESM 10% (w/w)، PCL و w/w) 10% ) از ابریشم در اسیدفرمیک 85% تهیه خواهد شد. به منظور دستیابی به محلولی یکنواخت، همه محلولها به مدت 3 ساعت همزده خواهد شد. 1-2- تهیه ی نانوالیاف پلیمری egg shell/silk fibroin /PCL با استفاده از روش الکترواسپینینگ با تغییر پارامترهایی از قبیل سرعت تزریق،ولتاژاعمالی، فاصله نازل تا جمع کننده بهترین شرایط برای الکترواسپینیگ را بدست آورده سپس محلول های مختلف، با نسبت ها و غلظت های متفاوت بمنظور تهیه ی نانوفیبرها مورد استفاده قرار خواهد گرفت . بهترین سیستم بدست آمده برای الکترواسپینیگ برای تهیه نانوفیبر PCL/Silkfibroin/ESM تهیه خواهد گردید. تهیه نانوالیاف پلیمری egg shell/silk fibroin /PCL بر پایه ی ژلاتین ﻣﺨﻠﻮﻃﯽ از ﻣﺤﻠﻮلﻫﺎی PCL/Silk fibroin/ESEM/Galatin ﺗﻬﯿﻪ خواهد ﺷﺪ .ﺑﺮای اﯾﻨﮑﺎر ﻣﻘﺪار ﻣﺸﺨﺼﯽ از ﻣﺤﻠﻮل PCL درون ﺑﺸﺮ 10 ﻣﯿﻠﯽﻟﯿﺘﺮی رﯾﺨﺘﻪ و ﺳﭙﺲ ﻣﻘﺎدﯾﺮ ﻣﺸﺨﺼﯽ از ﻣﺤﻠﻮلﻫﺎی ESM و اﺑﺮﯾﺸﻢ ﯾﮏ ﺑﻪ ﯾـﮏ و ﺑﻪ آﻫﺴﺘﮕﯽ اﺿﺎﻓﻪ خواهند ﺷﺪ. ﻣﻘﺎدﯾﺮ ﻃﻮری اﻧﺘﺨﺎب خواهند ﮔﺮدﯾﺪ ﮐﻪ ﻧﺴﺒﺖ وزﻧﯽ اﺟﺰا به صورتی باشد که ویسکوزیته مناسب برای الکترواسپینینگ داشته باشند. ﻣﺨﻠﻮط ﺑﻤﺪت 20 ﺳﺎﻋﺖ ﻫﻤﺰده ﺷـﺪ. ﭼﻨـﺪ ﺳـﺎﻋﺖ ﻗﺒـﻞ از انجام اﻟﮑﺘﺮواﺳﭙﯿﻨﯿﻨﮓ، ﻣﺤﻠﻮل ﮐﻤﯽ ﺣﺮارت داده خواهد ﺷﺪ و ﺳﺮﻋﺖ ﻫﻤﺰدن آﻫﺴﺘﻪخواهد ﺷﺪ ﺗﺎ ﺣﺒﺎبﻫﺎی ﻣﻮﺟـﻮد داﺧـﻞ آن از ﺑﯿﻦ ﺑﺮوﻧﺪ. خصوصیات نانوداربست های الکتروریسی شده توسط تکنیک زاویه تماس (Contact angle) و تست مکانیکی و مورفولوژی آنها از طریق میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) مورد بررسی قرار خواهد گرفت.برای تعیین ترکیب شیمیایی، طیف سنجی مادون قرمز (FTIR ) مورد استفاده قرارخواهد گرفت . : تهیه نانوالیاف پلیمری egg shell/silk fibroin / PCL بر پایه ی کیتوزان ﻣﺨﻠﻮﻃﯽ از ﻣﺤﻠﻮلﻫﺎی PCL/silk fibroin/ESM/Citosan ﺗﻬﯿﻪخواهد ﺷﺪ .ﺑﺮای اﯾﻨﮑﺎر ﻣﻘﺪار ﻣﺸﺨﺼﯽ از ﻣﺤﻠﻮل PCL درون ﺑﺸﺮ 10 ﻣﯿﻠﯽﻟﯿﺘﺮی رﯾﺨﺘﻪ و ﺳﭙﺲ ﻣﻘﺎدﯾﺮ ﻣﺸﺨﺼﯽ از ﻣﺤﻠﻮلﻫﺎی ESM و اﺑﺮﯾﺸﻢ ﯾﮏ ﺑﻪ ﯾـﮏ و ﺑﻪ آﻫﺴﺘﮕﯽ اﺿﺎﻓﻪخواهند ﺷﺪ. ﻣﻘﺎدﯾﺮ ﻃﻮری اﻧﺘﺨﺎب خواهندﮔﺮدﯾﺪ ﮐﻪ ﻧﺴﺒﺖ وزﻧﯽ اﺟﺰا به صورتی باشد که ویسکوزیته مناسب برای الکترواسپینینگ داشته باشند. ﻣﺨﻠﻮط ﺑﻤﺪت 20 ﺳﺎﻋﺖ ﻫﻤﺰدهخواهد ﺷـﺪ. ﭼﻨـﺪ ﺳـﺎﻋﺖ ﻗﺒـﻞ از انجام اﻟﮑﺘﺮواﺳﭙﯿﻨﯿﻨﮓ، ﻣﺤﻠﻮل ﮐﻤﯽ ﺣﺮارت داده خواهد ﺷﺪ و ﺳﺮﻋﺖ ﻫﻤﺰدن آﻫﺴﺘﻪ خواهد ﺷﺪ ﺗﺎ ﺣﺒﺎبﻫﺎی ﻣﻮﺟـﻮد داﺧـﻞ آن از ﺑﯿﻦ ﺑﺮوﻧﺪ. خصوصیات نانوداربست های الکتروریسی شده توسط تکنیک زاویه تماس (Contact angle) و تست مکانیکی و مورفولوژی آنها از طریق میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) مورد بررسی قرار خواهد گرفت.برای تعیین ترکیب شیمیایی، طیف سنجی مادون قرمز (FTIR ) مورد استفاده قرار خواهد گرفت . : کشت سلولهای بنیادی و انتقال سلولها بر روی نانوالیاف پلیمری زیست تخریب پذیر الف: کشت سلول: در این روش از رده سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی موجود در مرکز تحقیقات سلول های بنیادی استفاده می شود. سلول های در محیط کشت DMEM/LG حاوی FBS10% و 1% Pen-Strep تکثیر داده می شوند. بعد از 4-3 روز محیط کشت سلول ها تعویض می گردد. برای انجام پاساژ سلول، از محلول 25/.% Trypsin-EDTA استفاده می گردد. سلول ها در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با CO2 5% و رطوبت نسبی 95% کشت داده می شوند. ب: کشت سلول ها بر روی اسکفلد و زیستایی سلول بعد از پاساژ سوم، تعداد 104 ×1 سلول در هر سانتی متر مربع از سطح اسکفلد در پلیت های 24 تایی ریخته می شوند. بعد به مدت 7 روز در شرایط استاندارد کشت داده می شوند. بعد از این مدت میزان زنده مانی سلول با استفاده از روش MTT سنجیده خواهد شد. برای این کار محیط رویی سلول ها دور ریخته شده و سپس محلول 5 میلی گرم بر میلی لیتر بر روی سلول ها اضافه می شود. سلول ها به مدت 4 ساعت در شرایط استاندارد نگهداری می شوند. بعد از گذشت 4 ساعت محلول MTT خارج و حدود 200 میلی لیتر محلول DMSO به هر چاهک اضافه شده و به مدت 20 دقیقه در شرایط دمای آزمایشکاه قرار داده می شوند. میزان OD مایع رویی با استفاده ار دستگاه میکروپلیت ریدر با طول موج 570 نانومتر قرائت می شود. میزان بقاء سلولی به صورت % زنده مانی گروه کنترل بیان می شود. 4- تصویر برداری سلول ها بر روی اسکفلد با استفاده از میکروسکوپ SEM به منظور نشان دادن اتصال سلول بر روی اسکفلد و اتصال سلول به سلول، سلول های کشت داده شده بر روی اسکفلد با استفاده از روش تصویر برداری میکروسکوپ SEM بررسی می شوند. سلول ها با استفاده از محلول 2% پارافرمالدهید به مدت 20 دقیقه فیکس می شوند. سپس در محیط خلاء ابگیری می شوند. سپس با طلاء پوشش داده شده و از طریق میکروسکوپ Tescan تصویر برداری می شوند.