چاپ صفحه |  صفحه نخست سامانه |  اطلاعات تفضيلي |  مخترعين |  دانلود | علوم پزشکي تبريز |
| عنوان اختراع | فرایند تولید پروتئین A استافیلوکوکی به روش دست ورزی ژنتیکی جهت تخلیص آنتی بادی و ایمونوگلوبولین G |
| عنوان اختصاري | |
| شماره ثبت اختراع | 110255 |
| تاريخ ثبت اختراع | 1402/09/15 |
| اختراع حقيقي است يا حقوقي | |
| مدت حمايت از اختراع | |
| نام محل ارائه | |
| تاريخ ارائه | |
| اعتبار کلي | |
| نوع اختراع | |
| نام شرکت/سازمان متبوع |
| آيتم اطلاعات تفضيلي | متن |
|---|---|
| ادعاهای اختراع | ادعانامه آنچه ادعا می شود: ادعای 1) محصول پروتئین A بصورت نوترکیب با حفظ ساختار اسیدآمینه ای به صورت native، در سیستم بیانی پروکاریوتی در فرمانتور آزمایشگاهی به روش تخمیر غوطه ور تولید شده و تخلیص اختصاصی ایمونوگلوبولین و آنتی بادی آن با توجه به ضریب خاموش پایین نسبت به نمونه های تجاری بهینه سازی گردید. ادعای 2) مطابق ادعای شماره 1، شناسایی و تکثیر(PCR) ژن SPA کد کننده پروتئین A از استافیلوکوکوس اورئوس بومی صورت پذیرفت. ادعای 3) مطابق ادعای شماره 1 و 2، محصول PCR هضم و به وکتور بیانی pET22b (+) با استفاده از آنزیم های NdeI و XhoI در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت انتقال یافت. ادعای 4) محصول به دست آمده در مورد ادعایی 3 ، جهت اتصال (Ligation) در حجم نهایی 25 میکرولیتر و نسبت ۱ به ۳ از وکتور و محصول ژنی هضم شده در حضور ۲ میکرولیتر آنزیم T4 در دمای ۱۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۶ ساعت قرار گرفت. ادعای 5) محصول ژنی به دست آمده مطابق مورد ادعایی شماره 4، به کمک شوک حرارتی در E. coli BL21 اتصال یافت و با افزودن IPTG در غلظت ۴/۰ میلی مولار به محیط کشت باکتری، تولید پروتئین A القائ گردید. ادعای 6) جهت لیز کردن محصول بدست آمده مطابق مورد ادعایی 5، محیط کشت باکتریایی با سرعت ۵۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ گردیده و جهت استخراج پروتئین نوترکیب تولیدی سلول باکتری از لیز بافر (شامل ۵۰ میلی مولار تریس، ۱۰۰ میلی مولار سدیم کلراید، ۱ درصد تریتون) ، نیتروژن مایع و سپس سونیفیکاسیون استفاده گردید. ادعای 7) محصول نوترکیب بدست آمده مطابق مورد ادعایی شماره 6، با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی در حضور۲۰ میلی مولار ایمیدازول تخلیص گردید. سپس با استفاده از بافر حاوی تریس ۵۰ میلی مولار، سدیم کلراید ۱۵۰ میلی مولار، بتامرکاپتواتانول ۱/۰ درصد و ایمیدازول ۲۰ میلی مولار مورد شستشو قرار گرفت. ادعای 8) محصول بدست آمده مطابق مورد ادعایی شماره 7، با کمک دنباله 6×His و با استفاده از بافر حاوی ایمیدازول 300 میلی مولار، سدیم فسفات ۲۰ میلی مولار و سدیم کلراید ۵۰۰ میلی مولار از رزین های نیکل ستون کروماتوگرافی تمایلی جداسازی گردید. ادعای 9) محصول بدست آمده مطالبق مورد ادعایی 8، در بافر حاوی سدیم کلراید ۱۰۰ میلی مولار و تریس۵۰ میلی مولار در دمای ۴ درجه سانتیگراد دیالیز گردید. ادعای 10) پروتئین نوترکیب دیالیزی بدست امده مطابق مورد ادعایی شماره 9، با استفاده از تکنیک وسترن بلاتینگ E. coli مورد تایید صحت بیان در سیستم بیانی قرار گرفت و با استفاده از کیت سنجش غلظت پروتئین و منحنی استاندارد BSA تعیین غلظت شد ادعای 11) محصول بدست آمده مطابق مورد ادعایی شماره 9 و 10 ، با استفاده از تکنیک FPLC تعیین خلوص نهایی گردید. ادعای 12) محصول بدست امده مطابق مورد ادعایی شماره 11، برای خالص سازی آنتی بادی/ایمنوگلوبولین مورد نظر از محلول پلاسما، بر روی رزین های سفاروزی به حجم 1میلی لیتر ایموبلایز گردید. ادعای 13) محصول بدست آمده از مورد ادعایی شماره 12، برای انجام فرایند کروماتوگرافی با سرعت 1 میلی لیتر بر دقیقه و در دمای 25 درجه سانتیگراد مورد استفاده قرار گرفت و ستون حاوی رزین ابتدا توسط بافر سدیم فسفات 100 میلی مولار (4/7=pH) متعادل سازی گردید. ادعای 14) محصول بست آمده از مورد ادعایی شماره 13، برای تخلیص ایمونوگلوبولین G، با پلاسمای انسانی رقیق سازی شده با بافر تعادل سازی 1 به 4 مورد تزریق قرار گرفت و با بافر سدیم فسفات 100 میلی مولار و سدیم کلراید 100 میلی مولار (4/7= pH) شست و شو گردید. این شستشو تا رسیدن میزان جذب در 280 نانومتر به کمتر از (002/0) و شستشوی پروتئین هایی متصل به صورت غیر اختصاصی به رزین ادامه یافت. ادعای 15) محصول بست آمده از مورد ادعایی شماره 14، برای تخلیص ایمونوگلوبولین G از پلاسمای انسانی با بوسیله دستگاه AKTA FPLC مورد ارزیابی قرار گرفت و پروتئین های اختصاصی (ایمونوگلوبولین G) با استفاده از بافر سیترات سدیم100 میلی مولار (3=pH) بدون تغییر در فعالیت ایمونوگلوبولین G، مورد آزاد سازی قرار گرفت. |
| خلاصه اختراع | خلاصه اختراع پروتئین A یکی از پروتئین های سطحی دیواره سلولی باکتریایی است که به دلیل تمایل بالای اتصال به ایمونوگلوبولین های انسانی به طور گسترده ای در فرآیندهای خالص سازی، تشخیص آنتی بادی، تشخیص سریع پاتوژن ها و آنالیزهای ایمونولوژیک مورد استفاده قرار می گیرد. در سالهای اخیر چندین روش مختلف برای جداسازی ایمونوگلوبولین ها بر اساس تکنیکهای کروماتوگرافی توسعه یافته اند که دارای مشکلاتی از قبیل حساسیت و میزان تخلیص پایین و غیراختصاصی، هزینه بالا، نشت لیگاند، پایداری پایین و از دست دادن فعالیت آنتی بادی در شرایط آزادسازی محیط اسیدی اشاره کرد. از اینرو، ما در این پروژه برای تخلیص ایمونوگلوبولین ها با هدف به حداقل رساندن موارد مذکور، پروتئین A نوترکیبی را از سویه استافیلوکوکوس اورئوس بومی، بدون دست کاری در ترتیب اسیدهای آمینه طبیعی ساختار آن برخلاف نمونه های مشابه، در وکتور بیانی مناسب در فرمانتور آزمایشگاهی به روش تخمیر غوطه ور تولید و بهینه کردیم، بطوریکه ضریب خاموشی پایین و راندمان تخلیصی IgG مناسب، حفظ فعالیت آنتی بادی و مقاوم به تغییرات فاکتورهای محیطی مانند pH، دما و شرایط انکوباسیون را داشته و قابل رقابت با نمونه های تجاری باشد. |
| مخترعين | درصد مشارکت |
|---|---|
| مصطفی اکبرزاده خیاوی | 45.0 |
| اعظم صفری | 55.0 |
| نام فايل | تاريخ درج فايل | اندازه فايل | دانلود |
|---|---|---|---|
| اختراع ششم.pdf | 1404/09/02 | 186419 | دانلود |
